专利名称：一种羊水与绒毛细胞培养基的制作方法近年来，由于环境压力的日益增加，在群体中和遗传有关的疾病的发生率明显地上升。预防严重的先天畸形和遗传疾病的发生，保证人类后代的健康和繁荣，是遗传学和医学的一项重要任务。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材，孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法。但由于羊水穿刺检查具有操作安全、妊娠流失率低于自然流产率以及诊断染色体异常较为可靠的特点，所以孕中期羊水细胞检查仍是最主要的方法羊水穿刺检查的主要对象是高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸形、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及染色体异常等疾病，同时，还可以用于胎儿窘迫现象的判断及确定胎儿成熟程度。羊水穿刺属于介入性产前诊断，每次抽取20ml羊水，占羊水总量的1/20 1/12，但羊水中活细胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意即致失败。即使培养成功，因分裂相少、形态不佳而达不到分析要求，无法进行进一步研究，使羊水产前检测的应用受到限制。因此，成功的羊水细胞培养，除需要严格的试验操作技术和经验外，培养基的质量也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道的脱落细胞，其中只有小部分是有活力的细胞(约O. 1% )。传统的羊水细胞培养基组成是基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12) +小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基的成功率低于30%，而且平均培养周期在20天，且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如 Chang HC(ChangHC, Jones Off, Masui H, Human amniotic fluid cells grown inahormone-supplement medium !suitability for prenatal diagnosis, Proc. Natl. Acad.Sci. ,Vol. 79,4795-4799(1982)) o 在 DMEM 与 F12 按 I I 混合的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子,分别为转铁蛋白(transferrin) 5mg/L、亚硒酸钠20nMol/L、胰岛素 10mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0. InMol/L、胰高血糖素(glucagong) Img/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 10、氢化可的松(hydrocortisone) InMol/L、睾酮(testosterone) InMol/L、雌二醇(estradiol) InMol/L、孕酮(progesterone) InMol/L。Chang HC把含此10种促生长因子配方的培养基称为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-I培养基。生长因子加倍的H-I培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-I在培养基添加较低含量的胎牛血清的情况下，依然能够明显增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生长速度，使培养成功率达到99%以上，培养周期缩短到10天左右。中国专利申请200910193962. 2公开了一种羊水细胞培养基，包含下列组份基础培养基，转铁蛋白，亚硒酸钠，胰岛素，三碘甲氟腺氨酸，胰高血糖素，碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，睾酮，雌二醇，孕酮，并在上述成分中加入了维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物。该专利申请通过添加维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物来达到增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期的效果。
本发明的目的是提供一种羊水与绒毛细胞培养基，它仍能够显著改进羊水细胞的培养效果，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，可减少培养时间(6-10天即可)，同时提高了细胞培养成功率，充分发挥了不同细 胞生长因子的协同作用。本发明的目的是提供一种羊水与绒毛细胞培养基及其配方，它含有较少种类的成分，使生产成本明显降低。为达到上述目的，本发明所采取的解决方案是具体方法如下 一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组份基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲系统。一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组分基础培养基 生长因子10000-100000单位/L 抗氧化剂0.1-0.3g/mL 抗生素50000-100000单位/L 缓冲系统10-50mmol/L。生长因子包含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子中的一种或多种。生长因子由成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子组成。生长因子中成纤维细胞生长因子表皮细胞生长因子淋巴细胞生长因子的单位比为(50 80) (10 40) (10 40)。抗氧化剂包括抗坏血酸及衍生物和盐等、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、维生素E及衍生物等的一种或几种。抗氧化剂优选抗坏血酸葡糖苷。缓冲系统选自磷酸缓冲液、Earle’ s平衡盐、Hank’ s平衡盐、HEPES缓冲液，碳酸盐缓冲液。缓冲系统优选HEPES/NaHC03缓冲系统。一种羊水与绒毛细胞培养基，优选包含下列组分一种羊水与绒毛细胞培养基，用于羊水细胞、绒毛细胞的培养。基础培养基可自行配制，也可通过商业途径获得，包括但不限于Dubecco’ sModified Eagle，s Medium(DMEM)、DMEM/F 12 培养基、Eagle，s Minimum EssentialMedium、F-12K 培养基、Iscove’ s Modified Dulbecco，s Medium 或 RPMI-1640 培养基。生长因子是指能够刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子，包括但不限于上皮生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、淋巴细胞生长因子。抗氧化剂是指是能够阻止氧气不良影响的物质，包括但不限于抗坏血酸及衍生物和盐等、去氧胆酸钠、柠檬酸钠、维生素E及衍生物。基础培养基 生长因子10000-100000单位/L 抗坏血酸葡糖苷0.1—0.3g/L
青链霉素50000—100000单位/L
HEPES/ NaHCO3 缓冲系统10-50mmol/L
占体积百分比的10%-30%的胎牛血清。抗生素是指用于减轻细菌、支原体和真菌污染的物质，包括但不限于青霉素、链霉
素、红霉素、氣霉素、土霉素、庆大霉素等。缓冲系统可以通过商业途径购买，包括但不限于磷酸缓冲液、Earle’ s平衡盐、Hank’ s平衡盐、HEPES缓冲液，碳酸盐缓冲液。HEPES是指4_羟乙基哌嗪乙磺酸。HEPES缓冲液是指由4-羟乙基哌嗪乙磺酸或其与盐配制的缓冲溶液。开放式培养是指在5% C02培养箱培养，通过C02调节培养系统PH值.封闭式培养是指可密闭培养，例如用一个紧密加盖的培养瓶。通过培养液里缓冲系统调节培养系统PH值.本发明所述抗生素中“单位”是指抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。本发明所述生长因子中“单位”是指生长因子对细胞的生长具有刺激作用，细胞的生长状况因生长因子生物学活性的不同而异，可以用生物活性表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(IU)。本发明组合物有益的技术效果(I)使羊水细胞及绒毛细胞克隆形成率和克隆生长速度明显增加，提高了细胞培养成功率。(2)大大降低了成本,利于产品规模化。(3)本发明所述培养基在4°C的温度下可以贮存2周；在_20±2°C的温度下可贮存24个月。具体实施例购自SMGA公司的DMEM/F12细胞培养基，注射用水，碳酸氢钠，上海科兴生物科技有限公司提供的HEPES，暨南大学提供的成纤维细胞生长因子与表皮细胞生长因子、惠州鸿雨科技有限公司的淋巴细胞生长因子，日本HAYASHIBARA的抗坏血酸葡糖苷，青链霉素。 提供下列实施例，以描述和进一步阐明本发明的某些实施方案和方面，并不能认为其是对本发明范围的限制。制备例I配制浓度20mmol/L的HEPES/NaHC03缓冲系统取4. 76g HEPES溶解在900ml注射用水中，用I. 5 3g的NaHCO3水溶液调节pH为7，然后用注射用水定容至1000ml，于4°C下保存。制备例2青链霉素双抗储备液的配制a)取青霉素I瓶100万单位，加水稀释成20万单位/ml。b)取链霉素I瓶80万单位，加水稀释成20万单位/ml。c)用a和b等比混合，于4°C下保存。实施例I (A-1培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加IOmmolHEPES/NaHC03缓冲液，添加50000个单位的成纤维细胞生长因子、10000个单位的表皮细胞生长因子、40000个单位的淋巴细胞生长因子，O. 3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的青霉素，然后用注射用水定容至1000ml。 实施例2 (配制A-2培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加15mmolHEPES/NaHC03缓冲液，添加50000单位成纤维细胞生长因子、15000单位淋巴细胞生长因子，O. 3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的链霉素,然后用注射用水定容至1000ml。实施例3 (配制A-3培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加20mMHEPES/NaHC03缓冲液，添加25000单位的表皮细胞生长因子、30000单位的淋巴细胞生长因子，O. 25g的维生素E、50000单位的I : I的青霉素/链霉素混合物，然后用注射用水定容至 IOOOml0实施例4 (配制A-4培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加25mMHEPES/NaHC03缓冲液，添加25000单位成纤维细胞生长因子、15000单位的表皮细胞生长因子，O. Ig抗坏血酸葡糖苷和O. 15g维生素E、80000单位的利福平,然后用注射用水定容至IOOOml0实施例5 (配制A-5培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加30mMHEPES/NaHC03缓冲液，添加40000单位的成纤维细胞生长因子，O. Ig抗坏血酸葡糖苷和
O.Ig抗坏血酸钠、70000单位的庆大霉素，然后用注射用水定容至1000ml。实施例6 (配制A-6培养基)
取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加40mMHEPES/NaHC03缓冲液，添加30000单位表皮细胞生长因子，O. Ig抗坏血酸葡糖苷和O. 05g抗坏血酸钠、100000单位的博来霉素，然后用注射用水定容至1000ml。 实施例7 (配制A-7培养基)取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加50mMHEPES/NaHC03缓冲液，添加40000单位淋巴细胞生长因子，O. 25g抗坏血酸钠、100000单位的卡那霉素，然后用注射用水定容至1000ml。实施例8 (培养基A-8)
取IL装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射用水溶解后，添加IOmmolHEPES/NaHC03缓冲液，添加10000个单位的成纤维细胞生长因子、10000个单位的表皮细胞生长因子、10000个单位的淋巴细胞生长因子，O. 3g抗坏血酸葡糖苷、50000个单位的青霉素，然后用注射用水定容至1000ml。实施例9 (培养基A-9)同上，添加20000个单位的成纤维细胞生长因子、40000个单位的表皮细胞生长因子、10000个单位的淋巴细胞生长因子。实施例10 (培养基A-10)同上，添加30000个单位的成纤维细胞生长因子、20000个单位的表皮细胞生长因子、20000个单位的淋巴细胞生长因子。试验例I :不同配方的培养基培养效果比较根据中国专利申请200910193962. 2实施例中DF-Jl的配方配制培养基。取实施例1-7所配培养基及DF-Jl培养基，分别向其中加入10%的胎牛血清。羊水细胞培养收集10份羊水样品(为18-22周龄之间的羊水样品，每份约20-25ml，共240ml)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行。在无菌条件下取羊水各30ml/管，共8管。以1500rpm 离心 IOmin在无菌操作台上吸去上清液，每管约留1ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，向管中加入4ml培养基，吸管轻轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置于含5% C02的37°C培养箱饱和湿度下开放式培养。6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5ml，24-48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素O. 04-0. 08 μ g/ml, (20 μ g/ml，7号针头垂直滴加2滴)4-6小时进行细胞学处理。收获细胞倒出瓶中细胞液入IOml离心管，O. 85% NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，
O.25%胰酶消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。室温离心1500rpm, IOmin,去上清液。低渗加入370C O. 075M KCl 4_6ml，吸管吹打，37°C水浴 10-15 分钟。预固定加入I. 5ml甲醇冰醋酸=3 I固定剂，轻混匀37°C水浴5分钟，1500rpm离心IOmin0去上清，约留O. 5ml。
固定加入固定剂，轻混匀，37°C水浴10分钟，1500rpm离心lOmin。去上清，约留
O.5ml ο重复固定同上。1500rpm离心lOmin。去上清，根据管底细胞量加入适当几滴固定剂。滴片、烤片每片1-2滴，7 5°C烤箱烘烤3小时。培养结束染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有分裂相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计分裂相细胞数目。羊水细胞收集样品I培养8天后收获，进行染色体制片，结果见表I。表I各配方培养基对羊水细胞的培养效果比较


本发明涉及一种羊水与绒毛细胞培养基，属于细胞生物学领域。羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组份基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲系统。本发明能够减低成本，并且能够迅速有效地提高体外增殖的羊水与绒毛细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期，获得分裂相染色体数目多的羊水与绒毛细胞培养基及其配方。