专利名称：一种人白细胞介素29的变异体及其制备方法人白細胞介素^(interleukin 29，IL-29)是近年发现的一种新的細胞因子， 其结构和功能与I型干扰素(interferon，IFN)相似，因此又称为IFN-λ 1 (Sh印pard P， Kindsvogel W, Xu W, et al. (2003)IL-28, IL_29and tneir class II cytokine receptor IL-28R. Nature Immunol. 4(1) :63-68 ；Kotenko SV,Gallagber G,Baurin W,et al. (2003) IFN-Xs mediate antiviral protection through a distinct class II cytoKine receptor complex. Nature Immunol.4 (1) :69-77)。人IL-四基因定位于19号染色体长臂(19ql3. 13)，包含5个外显子，其基因结构与IL-IO家族成员的基因结构相似，但与I型干扰素的基因结构(只含一个外显子) 有明显差异(Onoguchi K, Yoneyama M, Takemura A, et al. (2007)Viral infections activate types I and III interferon genes through a common mechanism. J Biol Chem. 282 (10) :7576-7581)。IL-29 的 mRNA 全长 856bp，其开放读码框为 603bp,编码的蛋白质肽链含200个氨基酸残基，肽链氨基端的19个氨基酸残基构成信号肽序列，因此，人 IL-29的成熟肽是含181个氨基酸残基的多肽链。IL-四基因表达盒中启动子的结构与I 型干扰素的非常相似，都包含与干扰素启动子结合蛋白3、干扰素启动子结合蛋白7的结合位点以及至少有ー个功能性的核因子κ B结合位点。人IL-四通过与細胞膜上的受体复合物结合，起始信号的转导和发挥生物学作用。IL-四和IL-观共用ー个由ILj8Rl和IL-10R2组成的异ニ聚体受体复合物，其中 IL-28R1为结合亚基，IL-10R2为辅助亚基。ILj8Rl是IL-四和IL-28的共用受体中所特有的结合亚基，对IL-29的细胞应答具有特异性，辅助亚基IL-10R2也是I型干扰素、 IL-10、IL-22和IL-26的受体组成部分，其在造血和非造血細胞中普遍表达，对IL-29的细胞应答无特异性(Witte K, Gruetz G, Volk HD, et al. (2009)Despite IFN-Iambda receptor expression, blooa immune cells, but not keratmocytes or melanocytes, have an impaired response to type III interferons implications for therapeutic applications of these cytokines. Genes Immun. 10(8) :702-714)。人IL-29与I型干扰素共享相同的Jak-STAT信号传导途径，激活相同的 Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcription)信号转导途径，促进 ー组共同的基因表达。IL-四首先与其受体复合物形成II28R1-IL29-IL10R2三元络合物，然后通过定位在細胞内的两条受体链转导信号，启动信号级联反应，使STAT1、STAT2、 STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸残基磷酸化，然后促使ISGF3 (干扰素刺激基因幻进入細胞核与ISRE (干扰素刺激应答元件)相互作用，从而产生效应(Zhou Ζ, Hamming 0J, Ank N, et al. (2007)Tvpe III interferon (IFN) induces a type I IFN-Iike responsem a restricted subset of cells througn signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. J Virol. 81 (14) 7749-7758)。因此，IL-四表现出ー些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。研究发现，人体表达ILjSRl的细胞谱系较少，人体不同器官的ILjSRl表达水平有明显差异。在胃肠道、呼吸系统、心脏和ー些腺体細胞的IL-28R1高水平表达，而大脑细胞表达水平最低(Katrin W,Ellen ff,Robert S，et al. (2010) IL-28A，IL-28B，and IL-29 Promising cytokines with type I interieron-like properties.しytokine & wowth Factor Reviews. 21 (4) :237-251)。这种受体分布的组织差异性，提示IL-四的生物学作用具有较独特的细胞靶向性，即IL-四作用的靶细胞呈局限性，由此可避免IL-四对多种細胞产生广泛的生物学效应，从而有效的降低毒性作用。已有研究表明，对IL-28B肽链中的氨基酸残基进行诱变，可使IL-28B变异体的抗病毒活性发生显著改变(Gad HH, Dellgren C，Hamming 0J, et al. (2009) Interferon{lambda}is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-lOfamily. J. Biol. Chem. 284,20869-20875)。由于 IL-28B 与 IL-29 的同源性高达81%，而且两者共用相同的受体，由此提示IL-四变异体具有潜在的临床应用前景，有希望研制开发出临床疗效高而副作用比I型干扰素更小的新一代干扰素药物。
本发明的目的是提供ー种利用酵母表达重组人IL-四变异体(hILj9t)的制备方法及其酵母工程菌。本发明提供的技术方案如下(1)本发明的第一方面，提供ー种hIL-四变异体的重组真核表达载体，该载体是将pPIC9KM(源于hvitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为 201110410391.0)与本发明所述的hIL-四变异体编码基因(SEQ ID No :1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为pPIC9KM-hILj9t，如图1所示；该重组载体表达的产物是肽链中有2个氨基酸残基发生突变的hIL-四变异体(SEQ ID No 2)；而且，本发明将pPIC9KM 的α因子中的限制性内切酶》ιο I识别位点CTC GAG与蛋白酶Kex2的识别位点GAG AAA AGA (编码产物为Glu-Lys-Arg)，通过PCR方法引入hIL-四变异体编码基因(SEQ ID No 1)的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL-四变异体(SEQ ID No:2)的肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-四变异体的重组酵母工程菌GS115/ hILj9t，该工程菌是毕赤酵母GS115anvitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载体pPIC9KM-hIL-29t转化而获得，而且pPIC9KM中的信号肽基因序列与hIL-四变异体的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-四变异体至培养液中。(3)本发明的第三方面，提供一种制备hIL-四变异体肽的方法，该方法包括以下步骤a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇为诱导剂，诱导重组酵母工程菌表达hIL-四变异体；b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；c)除盐后的培养上清用强阳离子交換层析柱分离纯化培养液中的hIL-四变异体，收集含有hIL-四变异体的洗脱液；d)将含有hIL-四变异体的洗脱液用分子筛层析方法进ー步纯化；e)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鉴定纯化的hIL-四变异体。图1为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL_29t的构建图谱图2为人IL-四变异体编码基因的PCR扩增结果图3为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL_29t的双酶切鉴定结果图4为纯化的重组hIL-四变异体的SDS-PAGE检测结果市ο


本发明提供了一种重组人白细胞介素29(hIL-29)变异体的制备方法及表达重组hIL-29变异体的毕赤酵母工程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤1)人工合成引物；2)从健康人外周血单个核细胞经反转录PCR得到hIL-29变异体的编码基因；3)构建含有hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体，融合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工程菌；4)培养重组毕赤酵母工程菌，于培养液添加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达重组hIL-29变异体；5)采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上清纯化重组hIL-29变异体。本发明构建的重组毕赤酵母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表达重组hIL-29变异体，适用于工业化制备重组人白细胞介素29变异体。