人白细胞介素-17受体样分子融合蛋白及其编码基因与表达细胞系制作方法

熊世勤, 常智杰, 傅新元

2004年1月14日

2002年7月10日

2002年7月10日

清华大学

A61K38/20GK1467222SQ0212396

介素 受体 白细胞 融合 分子

1.一种人白细胞介素-17受体样蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有序列表中序列2的氨基酸残基序列3.一种人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因是序列表中序列1的DNA序列5.可溶性人白细胞介素-17受体样分子稳定表达细胞系X-931 CGMCC №0755及其突变体或变异体6.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗男性生殖不育、隐睾的药物中的应用7.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗睾丸癌、前列腺癌的药物中的应用8.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因，该融合蛋白的表达细胞系与应用；特别是涉及一种人白细胞介素-17受体样分子融合蛋白及其编码基因，该融合蛋白的表达细胞系与应用尽管目前至少已克隆了7种IL-17家族成员，但有关该家族成员的受体研究却知之甚少本发明的发明人经研究，发现了一种人白细胞介素-17受体样蛋白，并将其命名为hIL-17RLM-L(专利申请号02123447.7)该蛋白是一种I型单跨膜细胞因子受体，氮末端含有一个信号肽，一个跨膜结构域和一个较长的胞浆结构域，其较长的胞浆结构域还含有一个潜在的SH3相互作用结构域和众多的酪氨酸磷酸化部位，在胞浆邻膜区含有一个Toll/IL-1受体样结构域-TIRhIL-17RLM-L基因在肾及睾丸具有较多的表达，少量在心、脑、脾、子宫表达研究表明，hIL-17RLM-L在生精过程中具有细胞表达特异性，主要在睾丸组织的生精细胞、支持细胞表达，而在曲细精管基底膜部位的成纤维细胞和睾丸支持组织部位的间质细胞染色阴性在隐睾组织，生精过程中止，但是hIL-17RLM-L在曲细精管的生精细胞却有极强的染色hIL-17RLM-L可以使Stat5因子活化，同时还具有介导细胞增殖的作用可溶性Fc-受体融合蛋白经常被用来体外研究配体与受体之间的相互作用，及特异阻断IL-17RLM的潜在配体所介导的信号通路和生物学效应为了寻找IL-17RLM-L的潜在偶联配体，构建并表达纯化可溶性Fc受体与hIL-17RLM-L的融合蛋白是一种行之有效的手段本发明的目的是提供一种人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体的融合蛋白及其编码基因一种人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体的融合蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质本发明的融合蛋白由531个氨基酸残基组成一种人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体融合蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列本发明编码人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体融合蛋白的基因是由1620个核苷酸组成的DNA序列本发明的第二个目的是提供一株能够稳定分泌人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体融合蛋白的细胞系本发明提供的细胞系为可溶性人白细胞介素-17受体样分子稳定表达细胞系X-931 CGMCC №0755及其突变体或变异体细胞系X931，已于2002年06月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC №0755本发明巧妙地将人IgGl.Fc的编码序列克隆于pcDNA3真核表达载体，然后再将人白细胞介素-17受体样蛋白的胞外区亚克隆于pcDNA3-IgGl.Fc真核表达载体的N-末端，并使其编码阅读框一致，转染293T细胞，收集被转染细胞培养上清中的融合蛋白SDS-PAGE显示所纯化的融合蛋白具有较高的纯度本发明的融合蛋白可望在治疗男性生殖不育、隐睾、睾丸癌、前列腺癌及某些炎症性疾病(如类风湿性关节炎等)中得到广泛应用实施例3、采用RT-PCR方法对细胞系X931分泌蛋白进行鉴定分别使用受体胞外区编码序列的正义引物5’……ATAAAGCTTATGGAATCTCAACCTTTCCTG…..3’和人IgG1.Fc编码序列的反义引物5’…AATTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG…..3’，以野生型293T细胞为对照，采用RT-PCR方法对细胞系分泌蛋白进行鉴定，结果表明，细胞系X931含有Fc-受体融合蛋白的序列实施例4、采用Western blot对细胞系X931分泌蛋白进行鉴定1、搜集X931细胞培养上清液，0.45um滤膜过滤；2、将滤过的上清液经Hitrap HF亲和层析柱纯化，采用Millipore浓缩柱浓缩，-20℃或-80℃分装保存；3、添加20μl上样缓冲液溶解500mg纯化的可溶性本发明融合蛋白上样，行10％SDS-PAGE；4、于4℃冷室，100伏，300毫安转膜1.5小时；5、于丽春红染液约5分钟染色，标记蛋白分子量Marker；6、于封闭液(10％脱脂奶粉，TBST配制)，37℃孵育封闭45分钟；7、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；8、按照1∶5000-10000比例TBST稀释抗IgGl.Fc特异性抗兔血清，在37℃，一抗孵育膜45分钟，持续摇动；9、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；10、按照1∶1000比例TBST稀释二抗，在37℃孵育膜45分钟，持续摇动采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；11、按照1∶5000比例TBST稀释三抗，在37℃三抗孵育膜45分钟，持续摇动；12、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；13、将膜放在滤纸上简短晾干，与ECF底物孵育2-10分钟后，phosphoimager(520nm)显影结果表明，细胞系X931含有预期表达的Fc-受体融合蛋白的编码序列，能够稳定表达预期融合蛋白序列表<160>2<210>1<211>1620<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atggccccgt ggctgcagct ctgctccgtc ttctttacgg tcaacgcctg cctcaacggc60tcgcagctgg ctgtagccgc tggcgggtcc ggccgcgcgc ggggcgccga cacctgtggc120tggaggggag tggggccagc cagcagaaac agtgggctgt acaacatcac cttcaaatat180gacaattgta ccacctactt gaatccagtg gggaagcatg tgattgctga cgcccagaat240atcaccatca gccagtatgc ttgccatgac caagtggcag tcaccatcct ttggtcccca300ggggccctcg gcatcgaatt cctgaaagga tttcgggtaa tactggagga gctgaagtcg360gagggaagac 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Glu Leu Lys Ser110 115 120Glu Gly Arg Gln Cys Gln Gln Leu Ile Leu Lys Asp Pro Lys Gln125 130 135Leu Asn Ser Ser Phe Lys Arg Thr G1y Met Glu Ser Gln Pro Phe140 145 150Leu Asn Met Lys Phe Glu Thr Asp Tyr Phe Val Lys Val Val Pro155 160 165Phe Pro Ser Ile Lys Asn Glu Ser Asn Tyr His Pro Phe Phe Phe170 175 180Arg Thr Arg Ala Cys Asp Leu Leu Leu Gln Pro Asp Asn Leu Ala185 190 195Cys Lys Pro Phe Trp Lys Pro Arg Asn Leu Asn Ile Ser Gln His200 205 210Gly Ser Asp Met Gln Val Ser Phe Asp His Ala Pro His Asn Phe215 220 225Gly Phe Arg Phe Phe Tyr Leu His Tyr Lys Leu Lys His Glu Gly230 235 240Pro Phe Lys Arg Lys Thr Cys Lys Gln Gly Gln Thr Thr Glu Met245 250 255Thr Ser Cys Leu Leu Gln Asn Val Ser Pro Gly Asp Tyr Ile Ile260 265 270Glu Leu Val Asp Asp Thr Asn Thr Thr Arg Lys Val Met His Tyr275 280 285Ala Leu Lys Pro Val His Ser Pro Trp Ala Gly Pro Asp Ile Glu290 295 300Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala305 310 315Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys320 325 330Pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys335 340 345Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn350 355 360Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro365 370 375Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu380 385 390Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys395 400 405Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Thr Pro Ile Glu Lys Thr Ile410 415 420Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu425 430 435Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr440 445 450Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp455 460 465Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro470 475 480Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr485 490 495Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser500 505 510Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu515 520 525Ser Leu Ser Pro Gly Lys530 53