一种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体的制作方法[0002]白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1 (IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活性。美国食品和药物管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen公司的IL_lRa(商品名Kineret)上市，治疗常规药物无效的顽固性类风湿关节炎。这是继美国Immunex公司的重组肿瘤坏死因子受体(商品名Enbrel)上市后，第二个上市的治疗类风湿关节炎的基因工程药物。[0003]1990年,美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报道了克隆IL-1Ra的全长cDNA的结果，发现IL-1Ra与IL-1在结构上有同源性，在基因定位上与IL-1的2个亚型基因连锁，并且重组IL-1Ra能够特异性抑制IL-1的活性，这是第一个被发现的内源性细胞因子受体拮抗剂，为治疗炎症性疾病提供了新的途径。由于IL-1Ra的广谱抗炎作用，它还有可能在多种炎症性疾病的治疗中发挥疗效。例如，动物实验证明，IL-1Ra能有效治疗狗的骨关节炎、大鼠脑缺血再灌损伤、大鼠肠炎模型、豚鼠哮喘模型、小鼠肺纤维化、大鼠肾小球肾炎、小鼠移植物抗宿主反应等。我国学者发表的论文也证实IL-1Ra能有效治疗小鼠急性肺损伤、兔的严重角膜烧伤、大鼠角膜移植免疫排斥反应、大鼠实验性肝纤维化等。因而，IL-1Ra具有广阔的临床应用前景。目前，IL-1Ra开发的一个主要障碍是它的临床应用剂量很大，治疗类风湿关节炎需要每针75-150毫克的剂量，因此目前仍需要活性更高的白细胞介素-1受体拮抗剂。
[0004]本发明的 申请人:在已有的白`细胞介素-1受体拮抗剂:IL_lRa野生型(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ.1.D.NOUSEQ.1.D.N02所示)X线衍射晶体结构的基础上，对其活性中心附近的氨基酸进行了随机突变，获得了与白介素-1受体亲和力更高、生物活性更佳的突变体。[0005]本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体，分别为SEQ.1.D.N0.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸单点突变，其中第9位赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸和SEQ.1.D.N0.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸三点突变，其中第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。[0006]本发明还公开了上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体的制备方法，包括首先IL-1Ra野生型基因的获得然后获得各种突变体基因、IL-1Ra (突变体)表达载体构建、目的基因的表达和目的蛋白的纯化四个步骤，其中表达质粒为pET-22b(+)质粒，转化宿主菌为BL21(DE3)。[0007]得到的目的蛋白通过活性实验检测，结果表明野生型白细胞介素-1受体拮抗剂:IL-1Ra野生型中和拮抗IL-1的生物活性为国外已上市的Kineret (N端甲硫氨酸形式的白细胞介素-1受体拮抗剂)的2倍，各突变体的生物活性均优于野生型，其中三点突变的生物活性最好，为野生型的5倍。
[0008]本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体可以用来制备治疗炎症性疾病药物中的用途，其中炎症性疾病包括关节炎、肠炎、哮喘、肺纤维化、肾小球肾炎、移植物抗宿主反应、急性肺损伤、严重角膜烧伤、类风湿性关节炎。本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体优选用于类风湿关节炎的治疗。



[0009]图1:人IL-1Ra基因RT-PCR扩增结果1.RT-PCR扩增产物；2.DNA Marker,自上而下为 2、1、0.75,0.5,0.25,0.1kb ；
[0010]图2:pET-22b (+)物理结构图:其中T7为T7启动子，IacI为IacI编码区，ori为复制起始位点，Ap为氨节青霉素抗性基因，fl origin为fl复制起始位点；
[0011]图3:pET_22b(+)/IL-1ra物理结构图，相应部位同图2 ；
[0012]图4:含有人IL-1Ra cDNA的T载体双酶切图谱，其中1、2、3为质粒双酶切产物，4为 DNA Marker,自上而下为 21,5.1,4.9,1.9,1.38,1.37,0.95,0.56kb ；
[0013]图5:rhIL-lRa诱导表达SDS-PAGE电泳分析，M:分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD) ；1:诱导前菌体全蛋白;2~6:诱导1，2，3，4，5小时菌体全蛋白；
[0014]图6:rhIL-lRa诱导表达全菌及裂解物SDS-PAGE电泳分析，M:分子量标准(自上而下为97.4,66.2、43、31、20. 1,14.4kD) ；1~2:菌体全蛋白；3_4:菌体裂解后上清；5，6:菌体裂解后沉淀；
[0015]图7:rhIL-lRa免疫印迹分析M:分子量标准(自上而下为43、29、18、14.4kD) ；1:实施例3产品；2:Kineret ；
[0016]图8:生物活性比较结果,其中为Kineret,Wild type为野生型,Mutantl为第9位赖氨酸突变为亮氨酸，Mutant 2为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸，Mutant3为第26位精氨酸突变为赖氨酸，Mutant 4为第40位缬氨酸突变为亮氨酸，Mutant5为第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。

[0017]以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
[0018]实施例1野生型IL-1Ra基因及各型突变体基因的获得
[0019]取健康志愿者外周血15ml，密度梯度离心去除红细胞，收集淋巴细胞体外培养并加PHA刺激。培养结束收集淋巴细胞，用Trizol试剂抽提总RNA。
[0020]根据Genebank公布的IL-1Ra基因序列设计PCR引物:
[0021]引物1(SEQ1.D.NO 3):
[0022]5，TTGCCATATGCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGCGTCCGTCTGGGAGA
[0023]引物2 (SEQ 1.D.NO 4):
[0024]5， ATTGAAGCTTCTACTCGTCCTCCTGGAA[0025]设计序列时，在起始密码子ATG之前，加入了 Nde I的酶切位点；在起始密码子之后，加入了 His标签蛋白及EK酶切位点；而在最后Iv氣基fe Glu之后，立即有TAG作为终止密码，其后是Hind III的酶切位点。引物序列与IL-1Ra胞内可溶性蛋白152个氨基酸基因序列的两端互补。引物设计时将起始密码ATG之后的第36、39碱基A、C分别改为了大肠杆菌偏爱密码T、G，由于兼并密码子编码的氨基酸不变，因此对表达产物的氨基酸序列没有影响。
[0026]在0.5ml微量反应管中，24 μ I反应液中加入3’端引物200pmol/L，总RNA15y g，70°C加热5分钟后加入第一链缓冲液(TAKARA公司)、RNsin (Progema公司)、AMV逆转录酶(TAKARA公司)、dNTPs (TAKARA公司)，混合反应物于42°C反应I小时。
[0027]逆转录结束后于20μ I反应液中加入5’端引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶(TAKARA公司)，覆盖石蜡油。扩增条件为:94°C变性I分钟，65°C退火I分钟，72°C延伸1.5分钟，共30个循环，最后于75°C延伸5分钟。电泳检测扩增片段大小约为480bp，见图1。将扩增基因装入T Vector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司)，测序验证无误，其氨基酸和核苷酸序列分别为SEQ.1.D.NOU SEQ.1.D.N02所示。
[0028]Mutantl (K9L)基因
[0029]根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
[0030]引物3 (SEQ1.D.NO 5):5，CTGGGAGAAAATCCAGCTTGATGCA
[0031]引物4 (SEQ 1.D.NO 6):5，ATTCTGAAGGCTTGCATCAAGCTGG
[0032]引物I，(SEQ 1.D.NO 13):5，TTGCCATATGCACCATCATCATCAT
[0033]以野生型基因为模板，分别以引物I’与引物4、引物3与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入TVector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司),测序验证无误。
[0034]Mutant2(K9I)基因
[0035]根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
[0036]引物5 (SEQ 1.D.NO 7):5，CTGGGAGAAAATCCAGCATCATGCA
[0037]引物6 (SEQ 1.D.NO 8):5，ATTCTGAAGGCTTGCATGATGCTGG
[0038]以野生型基因为模板，分别以引物I’与引物6、引物5与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入TVector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司),测序验证无误。
[0039]Mutant3 (R26K)基因
[0040]根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
[0041]引物7 (SEQ 1.D.NO 9):5，AGAAGACCTTCTATCTGAAGAACAA
[0042]引物8 (SEQ 1.D.NO I O):5，GCAACTAGTTGGTTGTTCTTCAGAT
[0043]以野生型基因为模板，分别以引物I’与引物8、引物7与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入TVector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司),测序验证无误。
[0044]Mutant4 (V26L)基因
[0045]根据拟引入的点突变设计overlap PCR引物:
[0046]引物9 (SEQ 1.D.NO 11):5，ACTTGCAAGGACCAAATCTCAATTT[0047]引物10 (SEQ 1.D.NO 12):5’ ATCTTTTCTTCTAAATTGAGATTTG
[0048]以野生型基因为模板，分别以引物I’与引物10、引物9与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlap PCR。将扩增基因装入TVector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司),测序验证无误。
[0049]Mutant5 (R26K K9IV40L)基因
[0050]以Mutant3基因为模板，分别以引物I’与引物8、引物7与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlap PCR。获得中间MutantA。
[0051]以中间MutantA基因为模板，分别以引物I’与引物10、引物9与引物2进行PCR，反应条件同前，再以反应产物为模板，引物I’与引物2进行overlapPCR。将扩增基因装入T Vector (Promega公司)中，转化TGl菌株(Novagen公司),测序验证无误,获得中间Mutant5。
[0052]实施例2IL_lRa表达载体构建(以野生型基因为例，其余各型突变体构建方法与野生型相同)
[0053]表达质粒为pET_22b(+)质粒，结构图见附件。插入目的基因后原质粒的peIB引导序列被取代，示意图见图2及图3。
[0054]挑取含有测序质粒的重组TGl菌单克隆于LB培养液，过夜培养，小量质粒抽提试剂盒提取质粒，用Nde I和HindIII双酶切含有上述目的基因的中间载体，电泳回收480bp左右的小片段，结果见图4。将其插入用相同的两种酶酶切过的pET-22b(+)载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3) (Novagen公司)感受态细胞，载体自连作为对照。
[0055]实施例3目的基因`的表达(以野生型IL-1Ra为例，其余各型突变体表达方法与野生型相同)
[0056]质粒酶切图谱鉴定为正确后，用该质粒转化感受态BL21/DE3大肠杆菌，挑选10个克隆，分别接种在小试管中的LB培养基中，37°C振荡培养，待细菌生长到OD6tltol = 0.6时，留少量细菌悬液于_20°C后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG (TAKARA公司)，继续振荡培养，每隔I小时收获细菌直至5小时。
[0057]用15% SDS-PAGE观察不同克隆的细菌在加入IPTG之前以及之后的不同时间点的蛋白表达情况，结果显示全部克隆均在诱导后增加了分子量20kDa左右的蛋白条带。该条带分子量与文献报道的rhuIL-1Ra分子量一致，见图5。诱导表达4小时，目的蛋白的表达量达到最高，继续诱导表达量不再提高。
[0058]取经IPTG诱导表达的菌体冻融破碎，离心收集上清和沉淀，用15% SDS-PAGE电泳分析，结果目标蛋白主要在细胞破碎后的上清液中，表明IL-1Ra以可溶形式表达，见图6。重组蛋白经小量纯化后，用免疫印迹的方法检测(步骤:15% SDS-PAGE，半干法电转移至硝酸纤维素薄膜(200mA，30min)，用3% BSA将膜封闭后加抗人IL-1Ra单抗(R&D Systems)，室温孵育Ih后洗膜3次，再加入过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 二抗结合45min后，洗膜、显色)，结果提示IPTG诱导表达的蛋白性质与进口对照品rhIL-1Ra(Kineret) —致,见图7。
[0059]实施例4目的蛋白的纯化(以野生型IL-1Ra为例，其余各型突变体纯化方法与野生型相同)
[0060]发酵终止后，取出菌液，低速离心(5，000印111，20分钟，4°0，收集菌体，用生理盐水洗涤一次，所有上清液待灭菌后弃去。将湿菌体称量，于-20°C保存。取一定量的菌体，悬浮于适量的0.01mol/L PBS(pH 7.0)缓冲液中(菌体与悬浮液的体积比为I ;10)，冰浴下使用高压均质机进行碎菌，共3个循环；取样进行染色涂片，显微镜下检查，基本无完整细胞，离心20，OOOrpm, 20分钟，4°C，收集上清。上清经连接了 Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以粗制IL-1Ra为主(纯度大于70% )的蛋白溶液。
[0061]上述溶液加入一定量的重组牛肠激酶(rEK)(上海张江生物技术有限公司产品)，2mmol/L CaCl2，置21°C孵育20小时，将N端的Hi s标签蛋白及EK酶切位点去除，获得IL-1Ra粗制品。
[0062]IL-1Ra粗制品经0.8 μ m滤膜过滤后采用强阳离子交换介质SP-Sepharose FastFlow在pH 6.2进行离子交换层析，大量的可溶性细菌杂蛋白、核酸、内毒素等被去除，目标蛋白的纯度可以达到90%，收率在80%以上。提高pH至8.5，进行DEAE-S印harose FastFlow阴离子交换层析，可进一步去除残存的细菌杂蛋白、细菌内毒素，使样品纯度达到98%以上，获得IL-1Ra精制品。
[0063]实验例5生物活性比较实验
[0064]材料:
[0065]测活细胞:A375.S2黑色素瘤细胞系ATCC CRL-1872。
[0066]培养液:为含10%新生小牛血清(NBS)，RPM1-1640/D’ MEM(I: I)培养液。
[0067]胰蛋白酶:0.25%胰蛋白酶溶解于细胞培养用PBS中
[0068]Kineret:Amgen 公司产品。
[0069]方法:`[0070]1.用IOmL培养液稀释IL-1至终浓度为4ng/mL。
[0071]2.用步骤I培养液稀释样品至800ng/mL，在96孔板中连续2倍比稀释(最高浓度孔初始加入200 μ I,余孔各加入100 μ I稀释液,而后用多通道加样器自最高浓度孔吸出100 μ I加入下一孔，吹匀后继续向下重复，至最低浓度后吸出的100 μ I丢弃)，设置复孔。
[0072]3.取对数生长期的A375.S2细胞，胰蛋白酶消化，计数，普通培养液调整细胞密度至8 X 104/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔。
[0073]4.96孔培养板置于37°C 8%二氧化碳培养箱中培养。
[0074]5.72h后，加入新鲜配制的20 ；1混合的MTS/PMS溶液(Progema) 20 μ I/孔，在孵箱中继续孵育3小时，用酶标仪测量其A49tl-A63tl值。
[0075]结果:
[0076]
名称 Kineret Wild Mutantl Mutant2 Mutant3 Mutant4 Mutant5___Type______
EC50 20.8 13.1 10.4 6.3 3.2 3.0 1.6(ng/ml) _______
[0077]本发明中野生型IL-1Ra中和拮抗IL_1的生物活性约为Kineret的2倍，其余各型突变体生物活性均优于野生型，其中以Mutant 5活性最佳,约为Kineret的10倍。见图8。