重组人白细胞介素－2及其衍生物注射液和制备方法

程度胜, 张钰

2003年11月26日

2002年5月15日

2002年5月15日

程度胜, 北京四环生物工程制品厂

A61K38/20GK1457882SQ0211773

介素 白细胞 衍生物 重组

1.重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于它是以下述比例的原料和方法制成的注射液(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.05～2.00mg羟丙基-β-环糊精5～50mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.05～2.00mg聚山梨酯80 0.04～4.00mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg将以上各组分按下述步骤生产由于重组人白细胞介素-2及其衍生物是生物制品，故其生产条件应符合国家规定的标准整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套使用的器皿应干烤灭菌，消除热源按以上配方精确称取醋酸钠、醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质过滤时滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状按以上比例将溶液加入重组人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中2.根据权利要求1所讲的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于原、辅料配比的优选范围是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1～1.0mg羟丙基-β-环糊精10～20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1～1.0mg聚山梨酯80 0.04～0.4mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg3.根据权利要求1所讲的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于原、辅料的优选配比是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg羟丙基-β-环糊精20mg醋酸钠0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg聚山梨酯800.04mg醋酸钠0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠8.0mg4.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％5.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于本发明中使用的羟丙基-β-环糊精，是由羟丙基取代β-环糊精生成的水溶性环糊精衍生物，取代度为0.6～10.06.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于发明中使用的聚山梨酯80作为促溶剂，其使用的浓度范围是0.004％～0.4％(W/V)

本发明专利涉及重组人白细胞介素-2及其衍生物的一种新剂型具体涉及一种以重组人白细胞介素-2及其衍生物为原料药制备的注射液，本发明还涉及该药物的制备方法白细胞介素-2系由白细胞产生的淋巴因子，是一种多功能的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用临床上应用于晚期肾癌、恶性黑色素瘤及癌性胸腹腔积液的治疗，也可试用于其他恶性肿瘤的综合治疗采用低剂量的白细胞介素-2对结节性麻风病、支原体感染、疱疹及爱滋病进行免疫治疗也有良好疗效是临床疗效显著的基因工程药物之一重组人白细胞介素-2是利用基因工程方法克隆和表达的白细胞介素-2，它的功能和临床效果同白细胞介素-2一致目前，重组人白细胞介素-2及其衍生物的制剂均为冻干粉针剂，这是由重组人白细胞介素-2的不稳定性决定的但是现有的粉针剂存在以下一些不足①粉针剂在生产时需将药物溶液冻干结成固体，再直接升华除去水分此过程需特殊设备、耗时长、耗能大，故成本较高②重组人白细胞介素-2及其衍生物粉针剂在使用时要先用注射用水将其溶解才能注射，十分不便且易造成二次污染本发明的目的是提供一种临床使用方便、能够减少污染，降低生产成本、缩短生产周期的重组人白细胞介素-2及其衍生物的注射液和制备方法本发明由重组人白细胞介素-2及其衍生物、生理允许的醋酸缓冲系统、生理允许的促溶剂、和一定比例的氯化钠组成的注射液本发明中的重组人白细胞介素-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中共有三个半胱氨酸(Cys)分别在第58、105、125位，其58位与105位的Cys生成的二硫键为活性所必需，但125位为游离的Cys，并非其活性所必需，且易错配或生成二聚体，降低生物活性可以使用基因工程的方法利用点突变把Cys125改成Ser(丝氨酸)，或将Cys125变成Ala，或将104位的Met(蛋氨酸)变成Ala(丙氨酸)以上这些均属于重组人白细胞介素-2衍生物的范围故这些重组人白细胞介素-2衍生物被认为属于本发明的范围重组人白细胞介素-2是一种偏碱性的亲脂性蛋白质，少量溶解于水，利用大分子如PEG和肝素等化合物进行化学修饰，可增加其溶解性这些经修饰过的重组人白细胞介素-2也属于重组人白细胞介素-2的衍生物故这些重组人白细胞介素-2衍生物也被认为属于本发明的范围本发明中使用促溶剂目的是增加重组人白细胞介素-2及其衍生物的溶解度，人生理范围允许内的羟丙基-β-环糊精或聚山梨酯80均可以提高其溶解性，羟丙基-β-环糊精还能提高重组人白细胞介素-2及其衍生物的稳定性本发明中使用的羟丙基-β-环糊精，是由羟丙基取代β-环糊精生成的水溶性环糊精衍生物，取代度为0.6～10.0以上这两种物质应属于本发明中使用的辅料范围本发明是由以下两种组合制成的注射液(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.05～2.0mg羟丙基-β-环糊精5～50mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.05～2.0mg聚山梨酯80 0.04～4.0mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg本发明原、辅料配比的优选范围是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1～1.0mg羟丙基-β-环糊精10～20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1～1.0mg聚山梨酯80 0.04～0.4mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg本发明原、辅料的优选配比是重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1mg羟丙基-β-环糊精20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg聚山梨酯80 0.04mg醋酸钠 0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠 8.0mg将以上各组分按下述步骤生产由于重组人白细胞介素-2及其衍生物是生物制品，故其生产条件应符合国家规定的标准整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套使用的器皿应干烤灭菌，消除热源按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质过滤时的滤膜为0.22um，过滤后溶液呈澄清透明状按以上比例将溶液加入重组人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL～2依赖细胞株本发明研制成的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，具有以下优点①无须冻干，不需要冻干所需的特殊设备，车间和人员将生产周期缩短了两个工作日，节省了大量能源②临床使用时无须先用注射用水溶解，如制成预冲式注射剂包装形式还可直接注射，增加了使用的方便度，减少溶解过程中造成的二次污染的机会③在动物实验中观察到，本发明同现有的粉针剂型相比较，促进了药物的吸收，提高了药物的生物利用度用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株氯化纳 8.0mg本例中使用的羟丙基-β-环糊精的取代度为0.6～10.0将以上各组分按以下步骤生产生产条件应符合国家规定的标准整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套使用的器皿应干烤灭菌，消除热源按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株氯化纳7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.9mg聚山梨酯80 0.04mg醋酸钠 0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化纳 8.0mg本例中使用的羟丙基-β-环糊精的取代度为0.6～10.0将以上各组分按下述步骤生产生产条件应符合国家规定的标准整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套使用的器皿应干烤灭菌，消除热源按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株