专利名称：使用白细胞介素－11治疗出血性休克的制作方法相关申请本申请要求1999年6月8日提交的美国临时申请No.60/138,054的权益，该临时申请的内容全文参考收入本篇。在出血性休克和再恢复期间，胃肠系统受到严重的损伤。肠坏死会发生，随后的细菌转移和内毒素释放常常可以观察到(Tamion，F.，等人，美国生理学期刊，273(2Pt1)G314-21(1997))这常常会导致促炎细胞因子的显著增强的调节作用，这样会恶化多器官功能紊乱。因此，对肠胃系统有保护作用并能降低促炎细胞因子分泌的试剂如重组白细胞介素-11(“rhIL-11”)在治疗出血性休克中是有益的。本发明的简述申请人首先确定白细胞介素-11(“IL-11”)能改善出血性休克的存活。因此，本发明提供了使用IL-11治疗和预防出血性休克的方法。依据本发明，IL-11，其类似物，和衍生物可以预防性的或在与前面提及的病变有关的症状发作之后给患者服用。IL-11可以与适当的药物可接受的载体单独服用，或与其他用来减轻与这些病变有关的症状的传统试剂一起服用。在一个实施方案中，本发明包括一种预防出血性休克的方法，方法包括在症状发作前给哺乳动物服用治疗上有效量的白细胞介素-11。在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗出血性休克的方法，方法包括给经历这种病变的哺乳动物服用治疗上有效量的白细胞介素-11。本发明的详细描述引用的所有专利和参考文献如全文列出都参考收入本篇。本发明提供了使用IL-11预防和治疗出血性休克的方法。IL-11是一种从基质细胞种系衍生的多功能细胞因子(Paul，S.R.，等人，Proc，Natl，Acad.Sci，USA(1990))，其能刺激巨核细胞和血小板的产生(Bruno，E.，等人，Exp.Hematol.(1991)19378-385)，调节巨噬细胞前体的增殖和分化(Du，X.X.和D.A.Williams，血液(1994)832023-2030)，以及通过依赖于T淋巴细胞的机理刺激B细胞免疫球蛋白的产生(Yin，T.，等人，J.Exp.Med.(1992)175211-215)。最近的研究已显示IL-11对放疗和化疗引起的肠粘膜损伤(Du，X.X.等人，血液(1994)8333-37)以及对缺血性肠坏死(Du，X.X.等人，美国生理学期刊(1997)272G545-G552)有预防性保护作用。并且，放疗诱导的胸损伤程度(Redlich，C.A.等人，免疫学期刊(1996)，1571705-1710)和由内毒素性血症引起的死亡率也会通过服用IL-11而下降，说明IL-11可以作为抗-炎症细胞因子。(Barton，B.E.等人，传染病免疫学(1996)64714-718；Castagliuolo，I.，等人，美国生理学期刊(1997)273G333-G341；Misra，B.R.，等人，内毒素研究期刊(1996)3297-305)在1991年5月30日公布的国际申请PCT/US90/06830；以及1993年6月1日公布的美国专利No.5,215,895中对IL-11进行了详细的描述。1990年3月30日，克隆的人类IL-11预先存放在美国模式培养物保藏所(ATCC)，VA 20110-2209，Manassa，10801大学Boulevard，ATCC No.68284。并且，如在1993年12月14日公开的美国专利No.5,270,181；1994年3月8日公开的美国专利No.5,292，646中所描述的，IL-11也可以与另一种蛋白质重组制备成融合蛋白。通过借助目前常用的遗传工程技术IL-11可制备在多种宿主细胞中。此外，IL-11可以从多种细胞种系中获得，如人类肺成纤维细胞种系，MRC-5(ATCC保藏登记号No.CCL 171)和Paul等人的人类滋养层细胞种系，TPA30-1(ATCC保藏登记号No.CRL 1583)。在Proc.Natl，Acad.Sci.USA877512(1990)中所描述的是编码人类IL-11的cDNA以及推出的氨基酸序列(氨基酸1到199)。上述美国专利No.5,292,646描述了IL-11的des-Pro形式，其中IL-11的成熟形式(氨基酸22-199)的N-末端脯氨酸已被除去(氨基酸23-199)。如此领域中普通技术人员可以理解的，依据本发明保持了IL-11的活性的任何形式的IL-11都是有用的。除了重组技术，IL-11也可以通过已知的传统化学合成法制备。通过合成法构建可应用于本发明的多肽的方法对此领域中的技术人员是众所周知的。由于与自然的细胞因子多肽共有初级，二级，或三级结构和构象特点，合成构建的细胞因子多肽序列可以预计具有与细胞因子自然多肽共同的生物活性。这种合成构建的细胞因子多肽序列或其片段(其片段复制了或部分复制了细胞因子多肽序列的功能性)也可以使用在本发明的方法中。因此，它们可以用作为使用在本发明中的自然，纯的细胞因子的生物活性或免疫替代物。
对蛋白质，多肽或这些细胞因子的DNA序列或它们的活性片段的修饰也可制备可以使用在本发明的方法中的蛋白质。这种修饰的细胞因子可由此领域中的技术人员使用已知技术制备。对细胞因子序列，如IL-11序列的有意义修饰可以包括在编码序列中替换，插入或删除一个或多个选取的氨基酸残基。进行这种替换，插入或删除的致突变技术对此领域中的技术人员是众所周知的。(参看，如美国专利No.4,518,584。)如本文所描述的对治疗上有用的细胞因子多肽序列的其他特异诱变可以包括如，插入一个或多个糖基化作用位点。通过删除，替换或添加氨基酸到肽序列中或核苷酸到DNA序列中，天冬酰胺-结合糖基化作用识别位点可被插入到序列中。这样的改变可在通过添加O-结合糖类修饰的分子的任何位置上实施。这种改变的核苷酸或肽序列的表达产生在那些位点上的糖基化作用的变体。
预计能保持或延长全部其活性或部分其活性的，以及预计可使用在本发明方法中的所选取细胞因子的序列的其他类似物和衍生物也可由此领域中的技术人员方便地制备。一种这样的修饰可以是通过能将PEG组成附着的传统技术，将聚乙二醇(PEG)附着在细胞因子序列中存在的赖氨酸残基上，或将一个或多个赖氨酸残基或其他能与PEG琥珀PEG衍生物反应的氨基酸残基插入到序列中。
这些选取的细胞因子的其他类似物也可以是特点在于编码它们的DNA序列的等位基因变异，或编码它们的DNA序列的诱导变异。可以预计，在上面提及的出版物中公开的所有类似物，包括特点在于DNA序列能在严格杂交条件下或非严格条件下与公开的细胞因子序列杂交的那些类似物(Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室，纽约(1989))也类似地可使用在本发明中。同样考虑认为可使用在这些方法中的是融合分子，可通过将一种细胞因子的序列或生物活性片段与另一种细胞因子或蛋白质治疗试剂融合制备，如IL-11与IL-6融合(参看，如1992年3月19日公开的PCT/US91/06186(WO92/04455)中描述的融合方法)。可替换地，细胞因子的组合物也可依据本方法一起服用。
因此，在本发明的方法的描述中IL-11通过名称提出，此领域中的技术人员可以理解，IL-11包括通过此领域中目前公开的序列制备的蛋白质，以及特点在于通过上面描述的修饰仍保持基本上相同活性的蛋白质。
可使用在实施本发明的方法中的含有IL-11的药物组合物也可以包含药物可接受的载体，稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，稳定剂和/或其他此领域中众所周知的物质。“药物可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性以及对服用它的宿主没有毒性的物质。载体或其他物质的特点将取决于服用途径。
服用药物可以多种传统的方式实施。腹膜内注射是优选的服用方式。静脉内注射，经皮注射或皮下注射也可使用。对于注射用药，IL-11优选地以不含致热原，注射可接受的溶液形式服用。制备具有适当的pH，等渗性，稳定性等的这种注射可接受的蛋白质溶液在此领域的技术范围内。
用于治疗的IL-11的量取决于病况的严重性，服用途径，活性成分的反应性或活性，最终将由治疗的提供者决定。在实施本发明的治疗方法中，服用治疗上有效量的IL-11。“治疗上有效量”是指方法或组合物中的每种活性组分的总量足以显示有意义的患者受益(如，治愈，减轻，抑制，延迟或预防发作，预防复发或再发)。确定针对给定患者的治疗上有效量的一种常用技术是阶段地服用逐渐增加的剂量直到治疗提供者观察到有意义的患者受益。当使用个体活性成分时，单独服用，治疗上有效量的术语是指成分本身。当组合使用时，不论是顺序地还是同时地组合服用，术语是指产生治疗效果的活性成分的组合量。在本发明中治疗上有效剂量的IL-11考虑认为是在约0.1微克/公斤体重到约100毫克/公斤体重范围内，更优选的是在约1微克/公斤体重到约10毫克/公斤体重之间，最优选的是在约10微克/公斤体重到约1毫克/公斤体重之间。服用药物次数可以是变化的，取决于个体患者和疾病的严重性。
本发明已显示，第一次地，IL-11对出血性休克的保护性作用。通过向下调节炎症，预防组织受损，促进组织修复，以及最小化与休克相关的细菌/内毒素从内脏的转移，IL-11改善了出血性休克的存活。
通过参考下面描述的试验结果，本发明进一步得到示例演示和支持。
在大块小肠切除后，比较白细胞介素-11和表皮生长因子对残留小肠的作用(Fiore，N.F.，等人，J.Pediatr.Surg.(1998)33(1)24-29)。在切除后第4天和第8天体重类似。当与对照组和EGF比较时，在第4天和第8天用rhIL-11和IL-11-EGF治疗的动物具有增加的粘膜块。在EGF组中肌肉厚度显著增加。IL-11对小肠肠细胞有营养作用，致使细胞增殖并增加粘膜厚度。EGF对肠具有更全面的作用，致使肠细胞和肌细胞都增殖。含有或不含EGF的IL-11在短肠症的情况中具有临床效用。
在缺血性肠坏死的鼠科动物模型中，白细胞介素-11已显示出保护性作用(Du.，X.，等人，美国生理学期刊(1997)272(3 Pt1)G545-G552)。在患有肠缺血(通过闭塞大肠系膜动脉90分钟来诱导)的鼠中用rhIL-11预治疗显著地降低了发病率和死亡率。RhIL-11治疗的鼠表现出肠粘膜的快速恢复，同时增加了有丝分裂的活性，抑制肠滤胞腺细胞的细胞程序性死亡，增加了外周血小板和白细胞的数量。用载体治疗的鼠在缺血后发展出血小板减少症，当没用rhIL-11治疗的鼠发展出血小板减少症。
实例2系统炎症病况的模型rhIL-11改善了假单胞菌脓血症的噬中性粒细胞减少症(neutropenic)田鼠模型的存活(Opal，S.M.，等人，传染疾病期刊(1998)1781205-1208)。在试验开始时在胃肠道定居铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 的用环磷酰胺治疗的田鼠中发热开始发作时，经三天每天服用一次RhIL-11(150微克/公斤)。用RhIL-11治疗的动物在肺感染量化程度方面显著减少；肺水肿减少以及小肠和大肠的胃肠道上皮细胞的损伤显著减少。40％的用rhIL-11治疗的动物，60％用卷须霉素(ciprofloxacin)治疗的动物和100％用rhIL-11-卷须霉素(ciprofloxacin)治疗的动物存活，这些结果显示，rhIL-11支持消化道的粘膜完整性并降低免疫修改动物中对试验性革兰氏阴性菌感染反应的系统炎症。
在BALB/c鼠中，给定剂量的D-半乳糖胺和金黄色葡萄球菌肠毒素B作为由超抗原触发的T细胞介导中毒休克的模型(Barton，B.E.，等人传染病免疫学(1996)64714-718)，在超抗原在48小时以剂量相关方式降低死亡率之前，rhIL-11(5到500微克/公斤IP)预治疗1小时。与BSA治疗的动物的死亡率100％相比，在500微克/公斤死亡率为55％。
在内毒素性血症的兔模型中已评定了RhIL-11(Misra，B.R.，等人，内毒素研究期刊(1996)3297-305)。静脉内服用脂多糖(LPS)，30分钟后服用载体或rhIL-11(100微克/公斤静脉内)。在LPS服用后5小时用载体治疗的动物组的平均动脉压力为55％基线，而用rhIL-11治疗的动物的平均动脉压力为94％基线。与用载体治疗的动物相比，在用rhIL-11治疗的动物中回肠，盲肠和结肠的组织评定显示出下降的出血，水肿，和粘膜损伤。与用载体治疗的动物相比，用rhIL-11治疗的动物显示出显著降低的血浆硝酸盐/亚硝酸盐含量。这些结果说明rhIL-11能预防由于内毒素性血症引起的血压过低，并且说明这种作用与降低的血浆氮氧化物含量有关。
在内毒素性血症的鼠科动物模型中评定rhIL-11对促炎细胞因子血清含量的影响(Trepicchio，W.L.等人，免疫学期刊(1996)1573627-3634)。雌性C57BL/6J鼠用PBS或rhIL-11(500微克/公斤腹膜内注射)注射，4小时后用PBS或LPS注射。与仅接受LPS的动物相比，在服用LPS之前用rhIL-11治疗的动物具有显著低的TNF-α，IFN-γ，和IL-1β血清含量峰值，下降范围从80到95％。用rhIL-11预治疗不影响LPS-诱导的IL-6或IL-10产出，仅用rhIL-11治疗没有产生可检测量的IL-6或IL-10的血清含量。rhIL-11也抑制在IL-6缺损剔除鼠中LPS-诱导的TNF-α的产出。因此，在系统炎症反应期间，rhIL-11可以在体内减少促炎细胞因子的产生，并且这种活性不依赖于IL-10或IL-6的诱导作用。
在灼伤鼠中，白细胞介素-11改善了存活状况并减少了细菌转移和骨髓抑制(Schindel，D.，等人，J.Pediatr.Surg.(1997)32(2)312-315)。在高度致命的鼠科动物灼伤模型中评定IL-11对存活，肠细胞结构，细菌转移，和骨髓抑制的作用。使用灼伤模板对C3H/HeJ，8到10周大的鼠实施标准化的32％总体表面积(TBSA)的烫灼伤。将鼠等分为接受IL-11(125微克/公斤，每天两次，皮下注射(“SC”))的组和接受对照物(BSA)的组。灼伤7天后评定存活。在灼伤24小时后，与对照组相比，用IL-11治疗的鼠在肠系膜淋巴中有较少的肠细菌，肠滤胞腺细胞增加，肠绒毛高度增加，外周血小板和淋巴细胞数量增加，改善了存活状况。这些数据显示，在鼠32％TBSA灼伤后，IL-11改善了存活，肠细胞结构，降低了细菌转移，降低了骨髓抑制。
实例3出血性休克将Sprague-Dawley田鼠麻痹并且经10分钟放血28毫升/公斤(35％血量)以诱导急性出血性休克。休克75分钟后，将动物任意分成不同的治疗组。然后用3∶1(液体血液损失)含有rhIL-11(100微克/公斤)，抗-IL-11(5.7毫克/公斤)的乳酸化的Ringer溶液或仅有乳酸化的Ringer溶液静脉内注射经60分钟将它们苏醒。测定休克后3小时的血压。在休克后3小时将相同组的动物安乐处死，或允许动物从麻痹中苏醒并观察到休克后72小时。确定72小时的死亡率。然后将动物安乐处死。在验尸中，将回肠样品放置在10％缓冲中性福尔马林中，并随后检测评定小肠损伤的程度。获得肝和回肠的其他样品通过RT-PCR进行细胞因子mRNA含量的量化过程。在不了解治疗组的情况下通过评定仪对回肠切片进行显微检测。对肠样品进行下列程度的评分绒毛萎缩；滤胞腺萎缩；杯状细胞损耗；片段膨胀；和炎症细胞渗透。0分为无损害，而3分为严重损伤及坏死。
72小时后92％用rhIL-11治疗的动物存活，而分别仅有72％和79％的仅用乳酸化的Ringer溶液治疗的动物和用乳酸化的Ringer溶液和抗-IL-11治疗的动物存活。肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达量如下所示。在肝和回肠中，用rhIL-11治疗在苏醒时显著减少了TNF-α表达。
表1.72小时时RT-PCR TNF-α特异mRNA含量动物组 回肠 肝LR 3.8”0.17 3.7”0.17LR-抗-IL-11 4.0”1.0 4.9”0.75LR-rhIL-11 1.8”0.17*1.6”0.18H*P＝0.0089HP＝0.0002组织分析结果在表2中显示。加入到苏醒液体中的rhIL-11在3小时和72小时降低了组织损害分。在72小时时区别非常显著。72小时时样品的典型显微照片在

图1中显示。特别指出的是在乳酸化Ringer溶液组中绒毛完全破坏，而在rhIL-11组中绒毛表现相当正常。
表2.3小时和72小时时，rhIL-11和抗-IL-11对回肠组织损伤的影响
3小时LR 8 2.13”0.34 1.25”0.23 1.13”0.21 1.94”0.33 1.50”0.25rhIL- 7 1.50”0.38 0.71”0.24 0.71”0.21 1.64”0.37 1.36”0.2811抗-IL 6 1.83”0.33 1.00”0.39 0.83”0.28 1.50”0.43 0.25”0.21-1172小时LR 7 1.86”0.18 0.93”0.34 0.79”0.18 1.36”0.28 1.43”0.07rhIL- 8 1.13”0.16 0.19”0.13 0.19”0.13 1.19”0.25 0.88”0.2311P＝0.005 P＝0.04 P＝0.01 P＝0.33 P＝0.02抗-IL 7 1.83”0.33 1.00”0.39 0.83”0.28 1.50”0.43 1.25”0.21-11如表2中所示，加入到苏醒液体中的rhIL-11抑制了肝和回肠中TNF-α的表达，降低了72小时时肠损伤，改善了出血性休克后的存活。
此外，在与上面实例3中所描述的试验基本上相似的试验中，与从仅用乳酸化的Ringer溶液苏醒的对照组田鼠获得的肝和回肠细胞中相同的分子的表达相比，从用含有rhIL-11的乳酸化的Ringer溶液苏醒的田鼠获得的肝和回肠细胞中TNF，IL-6，促炎细胞因子和VCAM-1，ICAM-1粘着分子的表达减少。而从rhIL-11苏醒的田鼠的肝和回肠细胞的IL-10，和抗-炎症细胞因子的表达与从未治疗的对照组田鼠获得的相同细胞是可比的。并且，用rhIL-11苏醒的田鼠的动脉压力比未治疗的对照组田鼠的动脉压力要高。
总而言之，IL-11通过向下调节炎症，预防组织损伤，促进组织修复，最小化与休克相关的细菌/内毒素从内脏的转移，改善了出血性休克的存活。
虽然本发明已对具体的方法和组合物进行了描述，但可以理解的是此领域中的技术人员依据本发明考虑的事项可想到多种变通和修正。此领域中的技术人员也会想到如在上面演示实例中所描述的多种变通和修正，因此，只应对其加上所附权利要求书中呈现的限制。因此，所附权利要求书包括所有如权利要求的本发明范围内的等同物变通。
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本文公开了使用白细胞介素－11在(需要这种治疗的)哺乳动物中治疗出血性休克。