专利名称：一种白细胞介素-12的药物新用途的制作方法随着核能技术在国民经济中的广泛应用，因操作失误或违反安全规程等原因，造成人员受到较大剂量照射的事故也时有发生。1986年前苏联切尔诺贝利核电站事故后，巴西(1987)、萨尔瓦多(1989)、以色列(1990)、白俄罗斯(1991)、俄罗斯(1997)、爱沙尼亚 (1994)及我国的上海(1990)和吉林(1996)也相继发生了人员受照的辐射事故。因此急性放射病的防治是核事故应急医学处理十分重要的环节，是放射医学与防护研究的重点内容，受到各国学者的高度重视。急性辐射损伤(ARI)常表现为多系统损伤，其中骨髓造血功能抑制、放射性结肠炎、放射性肺损伤是常见的病理变化。骨髓造血功能抑制是ARI最主要的病理损伤，而且贯穿于放射损伤的始终，是患者死亡的主要原因。当机体受到致死剂量照射后，造血功能衰竭引起的感染，出血和代谢紊乱是造成死亡的主要原因，因此除了抗感染、抗出血等一些对症治疗外，使用造血因子来促使受损的造血功能恢复是治疗的根本途径。随着生物高技术的发展，造血因子的研究日趋深入，人重组造血生长因子如粒细胞集落刺激因子(G2CSF)、粒巨细胞集落刺激因子(GM2CSF)、促红细胞生成素(EPO)等因子已应用于对骨髓造血功能抑制患者的治疗，为ARI的救治开拓了新的途径。然而，绝大多数中重度ARI患者在渡过急性期后，仍会出现出血、感染等严重并发症，最终导致死亡。究其原因，一方面是由于目前应用的造血生长因子绝大多数仅能促进定向干细胞的增殖和分化，而对多能干细胞或祖细胞的作用甚微，虽能导致外周血细胞的短期升高，但缺乏较长期的作用；虽能使患者渡过所谓“骨髓无功能期”，但不能实现造血功能的重建。另一方面，如果仅升高患者的白细胞，未达到受损免疫系统的恢复和免疫功能的重建，患者仍会因免疫功能低下或异常，导致各种原因的感染而死亡。因此，造血功能的重建和免疫功能的恢复是急性辐射损伤救治的两个关键环节。如果能对这两个方面都有促进的药物，在治疗急性辐射损伤中将是非常有意义的。
针对上述问题，本发明公开一种白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)在制备治疗急性放射病的药物中的应用本发明的技术方案是这样的一种白细胞介素-12的药物新用途，是将白细胞介素-12在制备治疗急性放射病的药物中的应用。上述的一种白细胞介素-12的药物新用途，其中，所述的白细胞介素-12剂型为冻干制剂。上述的一种白细胞介素-12的药物新用途，其中，所述的白细胞介素-12在用于治疗急性放射病的时采用皮下给药的方式给药。为了更好的说明本发明的实质，下面对本发明的研究做详细说明。细胞介素-12(interleukin-12, IL-12)于 1989 年和 1990 年分别由 Trinchieri 和 Gately等发现，曾命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒力淋巴细胞成熟因子(CLMF)， 1991年统一命名为白细胞介素-12。IL-12是个异源性二聚体，分子量为75KD，由P35和 P40两个亚单位靠二硫键连结形成，能够刺激NK细胞和T细胞分泌IFN- γ，促进Thl细胞的分化，被认为是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。近20年来，有关IL-12的大部分研究都集中于免疫调控方面，认为其在抗肿瘤、抗感染免疫治疗中的发挥着重要作用。随着研究的深入，人们对IL-12的生物学活性有了更深入的认识。IL-12对紫外线造成的皮肤细胞有修复作用，主要通过对DNA的修复起作用。最近几年，又发现IL-12对造血干细胞的损伤也有修复作用。1993年，Jacobsen等通过单细胞克隆实验发现，重组鼠白细胞介素-12(rmIL-12)和多种细胞因子有协同作用，能促协同其它细胞因子促进小鼠骨髓中LirTSca-Γ细胞成倍增殖，尤其是能增强干细胞因子(SCF)诱导髓系LirTSca-Γ细胞增殖作用达7倍以上，还能和集落刺激因子(CSFs) —起协同诱导LirTSca-Γ干细胞增殖。 在没有rmIL-12时，生长因子很少或不能刺激高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFCs)增殖， 当加入50ng/ml rmIL-12刺激时，HPP-CFCs的集落形成均显著增加，证实IL-12是一种干细胞活化生长因子。这是研究者第一次对IL-12在造血功能上的认识。1994年，Bellone 等用小鼠实验研究了 IL-12对外周血和骨髓中造血祖细胞的作用，发现Ι-lOng/ml浓度的 rmIL-12和青灰因子(癌基因产物c_Kit的配体)及IL-3联用可以刺激红系、髓系和混合的细胞克隆形成。同时他们还将提前准备好的NK细胞和祖细胞一起培养，发现rmIL-12通过诱导NK细胞产生IFN-γ和TNF-α抑制由IL_3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子支持的造血细胞克隆的形成。因此他们认为IL-12可以直接刺激造血祖细胞增殖分化，也可以通过淋巴样细胞产生的两种细胞因子间接抑制造血，具有双向调节的作用。1997年，我国学者王宜强用真核表达载体获得分泌IL-12的基因修饰细胞，将其注射入受辐射处理的小鼠腹腔，发现IL-12有刺激造血恢复的作用。2007和2008年，美国南加州大学Chen认为单独使用小剂量rmIL-12 (lOOng/只) 就能够促进小鼠造血功能重建，能够促进三系血细胞恢复，而且产生IFN-Y的量极少，不会造成骨髓毒性，胃肠道病理检查发现并没有造成对胃肠道的损害。Basile也使用低剂量rmIL-12治疗放疗化疗后骨髓抑制的小鼠，发现放疗、化疗前后分两次给予更低剂量 (50ng/只)IL-12，促进造血功能恢复的作用更好。辐射引起的细胞凋亡是造成组织损伤的主要原因。为了明确何种细胞亚型受到 IL-12的保护，Chen等用流式细胞仪分析膜联蛋白V和细胞特异性标志物(Sca_l，c-kit, ⑶31，⑶105和碱性磷酸酶)双染色的细胞，发现rmIL-12治疗组膜联蛋白V7SCa-l+细胞远远高于对照组，而膜联蛋白V7c_kit+细胞数量在rmIL-12治疗组和对照组之间没有明显区别，而且辐射后24h两组都检测不到LirTSca-l+c-kit+细胞，曾有报道认为长期和短期造血干细胞存在于LirTSca-l+c-kit+细胞群中，所以推测辐射后重建骨髓的LTR HSC或许表达c-kit，但是用此方法检测不到。致死量辐射后可以发现给予低剂量rmIL-12治疗的小鼠的外周血细胞计数 (PBCC)先是出现下降，然后快开始回升，而对照组小鼠下降到最低点，相继死亡。亚致死量辐射后，低剂量rmIL-12治疗能够明显减少PBCC的下降，而且加速PBCC的恢复。和目前使用的造血刺激因子不同的是，rmIL-12能够促使包括白细胞、红细胞、血小板在内的全系血细胞恢复。放射线的强度不同，造成的损伤也会不同。IOOGy左右的极高剂量Ih内就可以导致神经和脑血管损伤，表现为中枢系统症状；超过15Gy的中等剂量辐射，4-6天就会因胃肠损害引起死亡；7_15Gy较低剂量的辐射后，死亡发生在1-4周，通常是因为造血功能破坏引起。Neta发现两个不同谱系的小鼠用rmIL-12(1000ng/只)治疗，接受12Gy和9Gy辐射，4-6天仍然死于胃肠综合症，而非rmIL-12治疗组接受15Gy或更高剂量才能诱发胃肠综合症，他认为rmIL-12会增加胃肠道对辐射的敏感性。然而Chen也通过病理检查发现经 IOGyy射线辐射后，低剂量rmIL-12 (IOOng/只)处理的小鼠和对照组的小肠绒毛、隐窝结构数量都保持完整，接受16Gy强度辐射后，低剂量rmIL-12治疗组胃肠道损伤的程度和对照组基本相同，照射后14天两组小鼠体重也没有明显不同，故Chen等认为rmIL-12在能够保护造血系统的剂量下没有显示出“辐射敏化反应”。说明适当剂量的rmIL-12能够治疗辐射后造血系统损伤，不会增加胃肠道对辐射的敏感性。申请人:在研究过程中发现正常小鼠造血干细胞表面、人新生儿脐带血干细胞以及经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员剂注射5次(一天一次)后外周血中造血干细胞 (CD34+)均存在IL-12受体表达，而骨髓的造血微环境中存在的间充质干细胞可以表达分泌 IL-12，所以研究者认为这为IL-12可以直接作用于干细胞、是造血干细胞维持正常生理功能所必需提供了依据。另外在研究中，小鼠受直线加速器辐射损伤时，IL-12能减少其干细胞的凋亡，并且能降低外周血中有核细胞的畸变率，提前促进骨髓造血，促进红细胞、白细胞和血小板的早日恢复。由于对仏-12诱生的0^-^可能对骨髓干细胞起到抑制作用的担心，我们进行的rmIL-12小鼠体内实验研究中，并没有增加骨髓IFN-gamma阳性T细胞的水平，并且IL-12还能降低骨髓淋巴细胞中⑶4+和⑶8+T细胞的百分率，可能因此而减轻 T细胞对骨髓的免疫抑制作用。综上所述，白细胞介素-12能通过造血干细胞上表达的IL-12受体，增强造血干细胞发生物理损伤时的抗凋亡作用，同时能促进生物体在包括Co60( γ射线)和直线加速器 (X射线)所引起的辐射损伤等导致造血系统损害时的修复作用，其在用于制备治疗急性放射病的的药物中有良好的应用前景。由于白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)的重组细胞表达稳定性要求，本发明所采用的白细胞介素-12(interleUkin-12，IL-12)的剂型为冻干制剂。在用于急性放射病的治疗时选用皮下给药的给药方式，其给药剂量范围控制在0. 01 μ g/kg 0. 2μ g/kg之间。与现有技术相比，本发明所提供了的技术方案，白细胞介素-12(interleUkin-12， IL-12)在制备治疗急性放射病的药物中的应用，扩宽了白细胞介素-12的使用范围，同时也为急性放射病的治疗提供了新的药物；并且从药效学实验的结果来看，对治疗急性放射病的具有很好的效果。图1是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血粒细胞数量的影响；图2是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血红细胞数量的影响；图3是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血血小板数量的影响；图4是本发明的IL-12对KM小鼠受8. OGy射线照射后30天存活率的影响。
“PE-Mo μ se IgG2a, κ2μ1
-< APC -c-kit2μΙ
L FITC -Sca-I2μ1
PE-CD212 (IL-12RP )2μ1
J APC -c-kit2μ1
FITC-Sca-I2μ1染色后的细胞在4°C的条件下，避光保存30分钟。(4)再用400ul PBS洗涤染色后的细胞2次(2000转/分钟、5分钟)(5)每管各加含0. 牛血清白蛋白的PBS 300 μ 1上机分析。分析方法是以骨髓单个核细胞的小细胞群设门分析。3结果与结论3. 1实验结果表1正常鼠骨髓造血干细胞IL-12R表达(％ ) (η = 11)
同型对照测定-
HSC IL-12R+1.28±0.59Α 3.67±1.84Α
AP = O. 0013. 2结论正常鼠骨髓造血干细胞上有IL-12R的表达。实施例2小鼠骨髓有核细胞经射线照射后HSC凋亡率表达实验目的观察IL-12对辐射损伤细胞的预防和治疗作用1. 1实验方法选用SPF级的昆明鼠，采用直线加速器4Gy辐射损伤，辐射前24h、辐射后24h各给药一次；照射后4天分别处死，检测骨髓HSC的凋亡率，以c-kit APC标记HSC，ArmexinVPE 为凋亡检测指标。(1)骨髓有核细胞制备BALB/c小鼠，颈部脱臼处死，无菌条件下取双侧股骨，用RPMI164完全培养液(内加10%胎牛血清)培养，用注射器反复吹打冲取骨髓，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，细胞用PBS洗2次(1000转/分钟、5分钟)JnBinding Buffur(IX)重悬，计数细胞， 调整细胞浓度为1 X 106/ml(2)流式检测方法染色每管200 μ 1细胞


一种白细胞介素-12的药物新用途，是将白细胞介素-12在制备治疗急性放射病药物中的应用，属于与现有技术相比，白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)在制备治疗急性放射病的药物中的应用，扩宽了白细胞介素-12的使用范围，同时也为急性放射病的治疗提供了新的药物；并且从药效学实验的结果来看，对治疗急性放射病的具有很好的效果。