专利名称：一种白细胞介素-12的新用途的制作方法再生障碍性贫血(aplastie anemia)简称再障，是一组由化学、物理、生物因素、药 物及不明原因引起的骨髓干细胞功能衰竭或异常，血液中全血细胞减少为主要表现的一组 综合症，临床上通常表现为贫血、出血和感染。引起再障的原因及发病机制目前还不十分清楚，某些药物、化学品和病毒已经在 流行病学上被确认与再障的发病有关，例如，药物有各种抗肿瘤药、氯霉素等；化学品中如 苯及其衍化物；乙肝病毒均可诱发再障；电离辐射X线、Y线等放射线照射也可导致再障。人体正常的造血依赖于多种不同类型细胞的相互作用而产生，包括造血干细胞 (HSC ；也称种子)和微环境细胞(也称土壤)。但是，后天再生障碍性贫血是种子的问题还是 土壤的问题呢？在过去三十年，研究者在种子异常和土壤异常的研究中的都积累了大量的 证据。但问题的难点是两者谁先发生以及两者之间是否有因果关系抑制性T细胞的异常 膨胀是否可能导致HSC的消耗和异常克隆，或者干细胞缺陷是否可能与微环境的继发异常 相关。目前医学界认为70%的再生障碍性贫血与自身免疫反应有关，是某些未知的造血 干细胞特异性自身抗原表位肽激活了 T淋巴细胞，造成特异性抗自身抗原T淋巴细胞克隆 的产生，从而导致造血组织和造血干细的损伤或毁灭。这些被激活的T细胞克隆属于细胞 毒性T淋巴细胞，具有Thl细胞的特性，表达和分泌干扰素-gamma。特异性⑶8+⑶28_淋巴 细胞在再障患者的外周血液中大量扩增，其细胞克隆特异性攻击自身骨髓造血干细胞，引 起骨髓造血干细胞凋亡。另外，骨髓中的炎症反应诱导了骨髓中T细胞和单核细胞分泌细胞因子，这些细 胞因子在骨髓衰竭的发展中可能发挥了重要作用。骨髓中少量表达的血清干扰素(INF-Y) 和肿瘤坏死因子(TNF)在体内可能可以诱导造血干细胞衰竭。然而，这些细胞因子本身是 否能诱导持续的骨髓衰竭尚不清楚。注射能清除骨髓抑制性细胞因子的抗体可能有助于了 解其在骨髓衰竭发展过程中的作用。据报道，注射一种清除TNF的抗体infliximab可改善 与类风湿性关节炎或MDS有关的慢性贫血。然而，TNF受体(p75)_ Fc融合蛋白却不能改 善大多数MDS病人的贫血。因此现在似乎没有临床证据表明骨髓抑制性细胞因子在骨髓衰 竭的发展中起重要作用。再生障碍性贫血以免疫抑制剂、造血干细胞移植和骨髓移植、雄性激素等治疗为 主。再生障碍性贫血患者可以根据血细胞减少水平为基础选择不同的治疗策略。目前推荐 的治疗方法，或多或少存在着各种不令人满意的地方①如造血干细胞移植和骨髓移植，寻 找相应的HLA相匹配的供体较困难，费用高昂以及发生排斥反应等不良反应。②免疫抑制 疗法总有效率达三分之一，在治疗有效者中复发率达20-30%，并发症10-15%，费用也很高。经常提及的抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)的主要成分是IgG，对人体来说ATG为异体蛋白， 毒副作用主要为过敏反应、血清病。环孢素(CsA)的毒副作用主要为肝毒性和肾毒性。ATG 与CsA联合应用的毒性反应主要仍是过敏反应、血清病及肝损害。③雄性激素治疗，虽然雄 性激素是治疗非重型再障(NSAA)的一线药物，但是丙酸睾酮的男性化副作用较大，出现痤 疮、毛发增多、声音变粗、女性闭经、儿童骨成熟加速及骨骺早期融合等。长时间使用对脑垂 体促性腺激素的调控造成调控紊乱。部分患者对雄激素有依赖性，停药后复发率达25% 50%，复发后再用药，仍可有效。④白细胞介素-ll(IL-ll)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、 促红细胞生成素(ΕΡ0)、血小板生成素(TPO)等直接作用造血系统的细胞因子，国内外专家 一致认为，并不推荐用于再障治疗，因此研究新的用于再生障碍性贫血的药物有极其重要 的意义。
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种白细胞介素-12 (interleukin-12, IL-12)在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用，扩宽了白细胞介素-12的使用范围，同 时也为再生障碍性贫血治疗提供了新的药物。本发明的技术方案是这样的一种白细胞介素-12的新用途，是将白细胞介素-12 在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。上述的一种白细胞介素-12的新用途，其中，所述的白细胞介素-12剂型为冻干制 剂。 上述的一种白细胞介素-12的新用途，其中，所述的白细胞介素-12在用于治疗再 生障碍性贫血时采用皮下给药的方式给药。为了更好的说明本发明的实质，下面对本发明白细胞介素-12 (IL-12)新用途的 研究做进一步说明白细胞介素-12 (interleukin-12，IL-12)于 1989 年禾口 1990 年分别由 Trinchieri 和 Gately等发现，曾命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒力淋巴细胞成熟因子(CLMF)， 1991年统一命名为白细胞介素-12。IL-12是个异源性二聚体，分子量为75KD，由P35和 P40两个亚单位靠二硫键连结形成，能够刺激NK细胞和T细胞分泌IFN- γ，促进Thl细胞 的分化，被认为是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。近20年来，有关IL-12的大部分研 究都集中于免疫调控方面，认为其在抗肿瘤、抗感染免疫治疗中的发挥着重要作用。随着研究的深入，人们对IL-12的生物学活性有了更深入的认识。IL-12对紫外线 造成的皮肤细胞有修复作用，主要通过对DNA的修复起作用。最近几年，又发现IL-12对造 血干细胞的损伤也有修复作用。1993年，Jacobsen等通过单细胞克隆实验发现，重组鼠白 细胞介素-12 (rmIL-12)和多种细胞因子有协同作用，能促协同其它细胞因子促进小鼠骨 髓中LirTka-Γ细胞成倍增殖，尤其是能增强干细胞因子(SCF)诱导髓系LinTca-Γ细胞 增殖作用达7倍以上，还能和集落刺激因子(CSFs) —起协同诱导LinTca-Γ干细胞增殖。 在没有rmIL-12时，生长因子很少或不能刺激高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFCs)增殖， 当加入50ng/ml rmIL-12刺激时，HPP-CFCs的集落形成均显著增加，证实IL-12是一种干 细胞活化生长因子。这是研究者第一次对IL-12在造血功能上的认识。1994年，Bellone 等用小鼠实验研究了 IL-12对外周血和骨髓中造血祖细胞的作用，发现Ι-lOng/ml浓度的rmIL-12和青灰因子(癌基因产物c_Kit的配体)及IL-3联用可以刺激红系、髓系和混合的 细胞克隆形成。同时他们还将提前准备好的NK细胞和祖细胞一起培养，发现rmIL-12通过 诱导NK细胞产生IFN-γ和TNF-α抑制由IL_3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子支持的造 血细胞克隆的形成。因此他们认为IL-12可以直接刺激造血祖细胞增殖分化，也可以通过 淋巴样细胞产生的两种细胞因子间接抑制造血，具有双向调节的作用。1997年，我国学者 王宜强用真核表达载体获得分泌IL-12的基因修饰细胞，将其注射入受辐射处理的小鼠腹 腔，发现IL-12有刺激造血恢复的作用。2007和2008年，美国南加州大学Chen认为单独使用小剂量rmIL-12 (lOOng/ 只)就能够促进小鼠造血功能重建，能够促进三系血细胞恢复，而且产生IFN- γ的量极少， 不会造成骨髓毒性，胃肠道病理检查发现并没有造成对胃肠道的损害。Basile也使用低 剂量rmIL-12治疗放疗化疗后骨髓抑制的小鼠，发现放疗、化疗前后分两次给予更低剂量 (50ng/只)IL-12，促进造血功能恢复的作用更好。但国内外文献上并没有应用重组人白细 胞介素-12 (rhIL-12)治疗再生障碍性贫血的报导。申请人:在研究过程中发现正常小鼠造血干细胞表面、人新生儿脐带血干细胞以及 经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员剂注射5次(一天一次)后外周血中造血干细胞(⑶34+) 均存在IL-12受体表达，而骨髓的造血微环境中存在的间充质干细胞可以表达分泌IL-12， 所以研究者认为这为IL-12可以直接作用于干细胞、是造血干细胞维持正常生理功能所必 需提供了依据。另外在研究中，小鼠受直线加速器辐射、环磷酰胺和氯霉素联合化学损伤 时，IL-12能减少其干细胞的凋亡，并且能降低外周血中有核细胞的畸变率，提前促进骨髓 造血，促进红细胞、白细胞和血小板的早日恢复。由于对IL-12诱生的IFN-Y可能对骨髓 干细胞起到抑制作用的担心，我们进行的rmIL-12小鼠体内实验研究中，并没有增加骨髓 IFN-gamma阳性T细胞的水平，并且IL-12还能降低骨髓淋巴细胞中⑶4+和⑶8+T细胞的 百分率，可能因此而减轻T细胞对骨髓的免疫抑制作用。综上所述，白细胞介素-12能通过造血干细胞上表达的IL-12受体，增强造血干细 胞发生物理化学损伤时的抗凋亡作用，同时能促进生物体在包括Co60 (γ射线)和直线加 速器(X射线)所引起的辐射损伤以及环磷酰胺和氯霉素所引起的化学损伤等导致造血系统 损害时的修复作用，其在用于制备治疗再生障碍性贫血的药物中有良好的应用前景。由于白细胞介素-12 (interleukin-12，IL-12)的重组细胞表达稳定性要求，本发 明所采用的白细胞介素-12 (interleukin-12, IL-12)的剂型为冻干制剂。在用于再生障 碍性贫血治疗时选用皮下给药的给药方式，其给药剂量范围控制在0. 01 μ g/kg 0. 2 μ g/ kg之间。本发明的技术方案，提供了白细胞介素-12 (interleukin-12，IL-12)在制备治疗 再生障碍性贫血药物中的新用途，并且从药效学实验的结果来看，对治疗再生障碍性贫血 具有很好的效果。图1是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血粒细胞数量的影响； 图2是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血红细胞数量的影响；图3是本发明的IL-12对5. OGy射线照射的小鼠外周血血小板数量的影响。PE-CD212 (IL-12Rβ)2μ1
APC -c-kit2μ1
FITC-Sca-I2 μ!

实施列1
鼠骨髓单个核细胞(HSC) IL-12R流式分析
试剂RPMI-1640 (GIBC0，美国)，胎牛血清(GIBC0，美国)，Ficoll淋巴细胞分离液(上 海华精)，CD3-PE、CD4-PreCP、CD8-FITC、IFN-y - APC、Rat IgGl-APC、BFA 均购自 BD Pharmingen 公司(Becton Dickinson/Phar Mingen MSA)。仪器流式细胞仪(FACS Calibur, BD公司，美国)，SW-CJ-2F型洁净工作台(苏 州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(SANYO，日本)，LXJ- II型离心机(上海医用分 析仪器厂)，XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。实验方法
(1)骨髓有核细胞制备
BALB/c小鼠8只，颈部脱臼处死，取双侧股骨，放入内加10%胎牛血清RPMI1640完 全培养液，用注射器反复吹打冲出骨髓，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。(2)将(1)中分离出的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)^il洗2次(1000转/分钟、10 分钟)，再加400μ1 PBS重悬细胞
(3)染色每管两个组合，每组200μ1细胞。
PE-Mo μ se IgG2a, K2μ1
APC -c-kit2μ1
FrTC -Sca-I2μ1染色后的细胞在4°C的条件下，避光保存30分钟。(4)再用400ul PBS洗涤染色后的细胞2次(2000转/分钟、5分钟) (5 )每管各加含0. 1 %牛血清白蛋白的PBS 300μ1上机分析。分析方法是以骨髓单个核细胞的小细胞群设门分析。(6)结果
正常鼠骨髓造血干细胞IL-12R表达ft) (n=ll)
同型对照测定HSC IL-12R+1. 28±0. 5943.6 土1.84矗
▲ P=O.001
(7)结论正常鼠骨髓造血干细胞上有IL-12R的表达。
实施例2
小鼠骨髓有核细胞经射线照射后HSC凋亡率表达实验目的观察IL-12对辐射损伤细胞的预防和治疗作用
实验方法选用SPF级的昆明鼠，采用直线加速器4Gy辐射损伤，辐射前M h、辐射后 24 h各给药一次；照射后4天分别处死，检测骨髓HSC的凋亡率，以c-kit APC标记HSC， Annexin V PE为凋亡检测指标。
(1)骨髓有核细胞制备
BALB/c小鼠，颈部脱白处死，无菌条件下取双侧股骨，用RPMI164完全培养液(内加10% 胎牛血清)培养，用注射器反复吹打冲取骨髓，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，细胞 用PBS洗2次(1000转/分钟、5分钟)JnBinding Buffur (1 X )重悬，计数细胞，调整细 胞浓度为1 X 106/ml (2)流式检测方法 染色每管200μ1细胞


白细胞介素-12能通过造血干细胞上表达的IL-12受体，增强造血干细胞发生物理化学损伤时的抗凋亡作用，同时能促进生物体在包括Co60(γ射线)和直线加速器(X射线)所引起的辐射损伤以及环磷酰胺和氯霉素所引起的化学损伤等导致造血系统损害时的修复作用，其在用于制备治疗再生障碍性贫血的药物中有良好的应用前景。