一种抗hiv中药的有效部位及其制备方法【技术领域】，具体涉及一种抗HIV中药有效部位的制备方法。[0002]艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV) 感染引起的一种严重传染性疾病。自美国1981年诊断出首例艾滋病病人以来，艾滋病病毒在全球范围内的传播速度惊人，已有200余个国家和地区受到艾滋病的严重威胁。艾滋病在全球的迅速蔓延，引起了世界卫生组织和各国的高度重视，投入了巨大的人力和财力用于抗HIV新药及疫苗的研发。目前已上市的抗HIV的药物，根据不同的作用机制可分为6大类:核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors,NR-TIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non- nucleoside analog reverse transcriptaseinhibitors, NNRT Is)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors, Pis)、融合抑制剂(fusioninhibitors, FIs)、进入抑制剂(entry Inhibitors, Els)和整合酶抑制剂(integraseinhibitors, Hs)。然而，现存的药物存在着抗耐药性差和毒副作用大等弊端，所以继续开发高效低毒且具有抗耐药性的艾滋病药物是当前新药研发领域具有挑战性的重大课题。[0003]在当前 药物存在弊端和抗艾滋病新药研发缓慢的形势下，人们开始关注传统医学，寻找天然抗HIV药物的研究正在蓬勃展开。到目前为止，已从天然药物中分离得到了生物碱类、黄酮类、香豆素类、木脂素类、萜类等具有抗HIV活性的化学成分，这些天然成分具有专属性强、毒副反应少、方便有效等优点。因此，从药用植物与海洋生物等天然药物中寻找抗HIV活性成分的研究受到越来越多的重视，现已成为抗HIV药物研究的新趋势(崔祥龙，等，天然药物中抗HIV活性成分研究进展【J】.现代生物医学进展，2010，10 (15):2989)ο
[0004]本发明的目的在于提供一种一种抗HIV中药有效部位的制备方法。[0005]本发明所采取的技术方案是: 一种抗HIV中药有效部位的制备方法，包括如下步骤:
(1)称取地龙适量，加入无水乙醇，超声提取，抽滤，滤液留用，重复该步骤2~3次，合并滤液，减压除去乙醇；
(2)在上述提取物中加入石油醚，超声溶解，静置后抽滤，在滤液中加入水萃取，取上相，重复2~3次，减压除去石油醚；
(3)将上述提取物上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯比例为20:3的洗脱液，减压除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中药有效部位。
[0006]作为优选的，步骤(1)无水乙醇的用量为地龙重量的2~4倍。
[0007]作为优选的，步骤(1)超声提取的条件为:25~30°C，200~300 W超声提取0.5 ~2h0
[0008]作为优选的，步骤(2)在滤液中加入等量的水萃取。
[0009]由上述方法制备得到的抗HIV中药有效部分。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明制备得到的抗HIV有效部位的CC5tl值为146.93 ±4.43 Pg/ml，其细胞毒性较小。该抗HIV有效部位的CC5tl值比其抗R5病毒感染活性的IC5tl值大得多，表明其可在较大浓度范围内对病毒感染产生抑制作用，而不对细胞造成较大的毒性。



[0011]图1是本发明抗HIV有效部位与N36结合的HPCE电泳图，其中，A为单独进本发明有效部位的电泳图，B为依次进本发明有效部位和N36 (100 μδ/πι1)的电泳图，C为依次进本发明有效部位和Ν36 (200 Pg/ml)的电泳图；
图2是对照药TF与N36结合的HPCE电泳图，其中，D为单独进TF的电泳图，E为依次进TF和N36的电泳图；
图3是本发明抗HIV有效部位与TF抑制HIV六螺旋束核心结构形成的N-PAGE电泳图，其中，I是C34的电泳结果，2是N36和C34共孵育后的电泳结果，3是终浓度为454 μδ/ml的本发明有效部位与N36和C34共孵育后的电泳结果，4是终浓度为454 μδ/πι1的TF与Ν36和C34共孵育后的电泳结果；
图4是本发明抗HIV有效部位与TF抑制HIV六螺旋束核心结构形成的N-PAGE电泳图，其中，I是C34的电泳结果，2是Ν36和C34共孵育后的电泳结果，3_5是终浓度分别为227Pg/ml、114 Pg/ml、45 Pg/ml的本发明有效部位与N36和C34共孵育后的电泳结果。

[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0013]实施例1
称取地龙50g，加入150 ml无水乙醇，静置30 min，28°C，250 W超声提取I h，抽滤，滤液留用，药渣再加125 ml无水乙醇提取两次，抽滤，合并三次滤液，减压除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超声溶解，静置2 h，抽滤，在滤液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，减压除去石油醚；提取物上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脱(混合液梯度为20:1，20:2，20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例为20:3的洗脱液，减压除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中药有效部位。
[0014]实施例2
称取地龙50g，加入200 ml无水乙醇，静置30 min,30°C,300 W超声提取1.5 h，抽滤，滤液留用，药渣再加100 ml无水乙醇提取两次，抽滤，合并三次滤液，减压除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超声溶解，静置2 h，抽滤，在滤液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，减压除去石油醚；提取物上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脱(混合液梯度为20:1,20:2,20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例为20:3的洗脱液，减压除 去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中药有效部位。
[0015]实施例3称取地龙50g，加入100 ml无水乙醇，静置30 min，25°C，200 W超声提取I h，抽滤，滤液留用，药渣再加150 ml无水乙醇提取三次，抽滤，合并四次滤液，减压除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超声溶解，静置2 h，抽滤，在滤液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，减压除去石油醚；提取物上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脱(混合液梯度为20:1,20:2,20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例为20:3的洗脱液，减压除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中药有效部位。
[0016]本发明制备得到的抗HIV有效部分作用于HIVgp41六螺旋束核心结构，为了证明其所具有的技术效果，我们采用实施例1制备得到的抗HIV有效部位进行了以下实验:
一、高效毛细管电泳(HPCE)柱端微反应器对本发明有效部位与N36结合的检测。
[0017]1.实验方法
I)配制磷酸盐缓冲液(PBS)，其组成为:30 mM NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7.2。
[0018]2)实施例1抗HIV有效部位用无水乙醇配成浓度为1000 μδ/πι1的溶液；茶黄素(TF)用PBS配成浓度为1000 μδ/πι1的溶液；Ν36用PBS配成浓度为100 μδ/πι1的溶液。
[0019]3)以PBS为缓冲液，电压为17 kV，重力进样，本发明有效部位及TF样品进样时间为10秒，N36溶液的进样时间为3分钟，用HW-2000色谱工作站进行谱图采集。首先分别获得本发明有效部位、TF和N36单独进样时的谱图，然后再获得依次进本发明有效部位和N36的谱图以及依次进TF和N36的谱图。
[0020]2.实验结果
本发明抗HIV有效部位与N36结合的效果如图1和图2的HPCE电泳图所示，从图中可以看出，在进了 N36的谱图中，本发明有效部位和TF的峰高明显降低，峰形发生了变化，可见，N36与样品在毛细管电泳过程中发生了结合；比较图1B和图1C，增大N36的浓度可使本发明有效部位的峰高降低更显著，可见，本发明有效部位与N36的结合呈剂量依赖性。
[0021]二、天然凝胶电泳(N-PAGE)法对本发明有效部位抑制HIVgp41六股螺旋束结构形成活性的检测。
[0022]1.实验方法
O配制不连续天然聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶为18%，积层胶为5%。
[0023]2)将有效部位10 μL与400 μδ/πι1的Ν36 6 μL在37°C共同孵育30分钟，再加入400 μδ/πι1的C34 6 μL在37°C共同孵育30分钟。
[0024]3)将孵育好的混合液与8 μL 2 X Tris-甘氨酸天然凝胶上样缓冲液混匀，加样到10X0.1 cm的天然聚丙烯酰胺凝胶孔中(每孔25 μL)，静置5分钟。室温120 V电压电泳2小时，考马斯蓝R250染色，脱色后用佳能400D相机拍照记录。
[0025]2.实验分组
本发明实验组:称取实施例1抗HIV有效部位适量，用DMSO溶解，用PBS配成浓度为1000 M-g/ml> 500 M-g/ml>250 M-g/ml 和 100 M-g/ml 的溶液。
[0026]TF对照组:茶黄素(TF)用水溶解，用PBS配成浓度为1000 μδ/πι1的溶液。
[0027] 3.实验结果
本发明有效部位对HIVgp41六螺旋束结构形成的抑制效果如图3和图4的N-PAGE电泳图所示，从图中可以看出，在未加药物作用的的空白对照样品中，N36和C34混合物形成两条带，箭头A所指的是gp41六螺旋束的条带，箭头B所指的是过量的C34的条带，其形成是因为N36发生了部分聚集而不能充分与C34结合形成六螺旋束，导致C34过剩；加入本发明有效部位或TF的样品中，六螺旋束结构的条带消失或仅可见很浅的条带，说明六螺旋束结构的形成明显受到了抑制。本发明有效部位在终浓度为227 μδ/πι1时几乎能完全抑制六螺旋束结构的形成，在浓度为114 μδ/πι1时能抑制大部分六螺旋束结构的形成，在浓度为45 μδ/πι1时能抑制部分六螺旋束结构的形成，其抑制程度随剂量的递增而增加。本实验证明本发明有效部位能够抑制HIVgp41六螺旋束结构形成。由此可见，本发明抗HIV有效部位具有抗HIV活性。
[0028]三、本发明有效部位抗HIV-1jkfl假病毒感染活性的检测
1、化合物抗R5病毒感染活性的检测 (O实验方法
按I X IO4/孔细胞浓度接种TZMb-1细胞100 μ I，次日细胞生长状态良好后，加入化合物(50 μ I)与R5病毒(50 μ I)于37 °C预孵育30 min得到的混合物，感染过夜，更换新鲜培养基。48小时后，用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测化学发光。
[0029]抑制率的计算公式为:抑制率=(I 一加药孔OD值/对照孔OD值)X 100%,半数有效浓度(IC5tl)采用CalcuSyn软件计算。
[0030]2)实验结果
本发明有效部位的IC5tl值为32.14±1.16 Pg/ml，小于阳性对照药T-20的IC5tl值(见表1和表2)，说明本发明有效部位具有抗R5病毒感染的活性。
[0031]表1