Hiv-1 ltr上顺式元件突变的真核细胞系统及其制备方法与应用的制作方法【技术领域】。具体地说，本发明涉及一种Hiv-1LTR上的顺式元件突变的真核细胞系统及其制备方法和应用，所述真核细胞系统可用于HIV-1的治疗药物筛选与信号通路机制研究。[0002]HIV-1基因表达极其依赖于宿主细胞内的转录因子[I]。HIV-1潜伏感染的一个重要分子机制就是相关转录因子的缺乏[2]。这是由于在静止CD4+T细胞中，细胞处于静止状态，细胞内部处于一种转录因子相对缺乏的情况。整合在宿主基因组里面的HIV原病毒可以被包括TCR信号，细胞因子(IL-Ιβ，IL-7，TNF-α等)，以及有丝分裂原(PMA，prostratin等)在内的多种T细胞活化信号激活[3]。这些信号最终驱动HIV转录是通过活化的细胞转录因子的诱导[3]。这些转录因子包括NF-κ B和AP1，它们能够结合到HIV LTR内的增强子序列。除此之外，病毒也会产生一些转录调控蛋白来调控自身基因的转录。例如，在转录调控方面很最重要的TAT蛋白(反式转录激活因子，transactivatoroftranscription, TAT)。它由人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基因编码，通过与反式激活应答(transactivating response, TAR) RNA序列结合以起始基因转录。HIV转录时TAR先转录形成一小段有着颈环结构的RNA。TAT可以结合到这段TAR转录形成的RNA，从而募集转录复合体的一些重要因子，从而保证HIV转录的顺利进行[4]，抑制TAT的表达能够诱导潜伏[I]。[0003]通过HIV LTR上顺式元件突变的细胞模型，可以有效进行药物筛选和信号通路研究。Hung-Chih Yang等利用缺失κ B位点的NL4-3LTR启动的Luc报告质粒筛选到转录因子Ets的一个突变型，Λ VI1-Ets-1，其能够有效地激活静止⑶4+Τ细胞中的HIV-1 [5]。Samuel A.Williams等也通过野`生型以及一些转录因子结合位点突变的LTR的Luc报告质粒来研究Prostratin激活潜伏HIV-1表达的信号通路机制[6]。[0004]但是上述瞬时转染细胞模型存在着很多缺陷，例如，细胞不能传代，不同批次实验之间可能存在较大误差等。因此本领域急需建立能够传代，而且实验之间误差较低的细胞模型，从而能够进行药物筛选与信号通路机制研究。
[0005]本发明的目的是提供一种HIV-1LTR上顺式元件突变的真核细胞系统。[0006]本发明的另一目的是提供上述真核细胞系统的制备方法。
[0007]本发明还有一目的是提供上述真核细胞系统在筛选HIV-1治疗药物中的应用。
[0008]本发明还有一目的是提供筛选筛选HIV I表达激活剂的方法。
[0009]本发明还有一目的是提供包含野生型HIV ILTR和报告基因，或突变型HIV ILTR和报告基因的质粒。[0010]本发明还有一目的是提供整合有突变型HIV ILTR和报告基因，从而稳定表达整合的所述报告基因的真核细胞。
[0011]在第一方面，本发明提供一种真核细胞系统，所述真核细胞系统包括以下细胞:
[0012](a)基因组中整合有野生型HIV ILTR和报告基因，从而稳定表达整合的报告基因的真核细胞；和
[0013](b)基因组中整合有突变型HIV ILTR和报告基因，从而稳定表达整合的报告基因的真核细胞。
[0014]在具体的实施方式中，所述报告基因包括GFP、LacZ。
[0015]在另一
[0016]在另一【具体实施方式】中，LTR和报告基因构成的LTR-Luc兀件是具有选自下组的核苷酸序列:
[0017]⑴所述野生型HIV ILTR和报告基因，包括SEQ ID NO:1所示HIV LTR和Luc报
告基因；
[0018](ii)所述突变型HIV ILTR和报告基因，包括SEQ ID NO:2所示HIVLTRΛ κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO: 3所示HIV LTR Λ TARO和Luc报告基因或SEQ ID NO: 4所示HIVLTR Λ APl和Luc报告基因。
[0019]在具体的实施方式中，所述整`合有野生型HIV ILTR和报告基因的真核细胞是将野生型HIV ILTR和报告基因插入P⑶ΝΑ3.0载体得到的重组质粒转染真核细胞得到的，所述整合有突变型HIV ILTR和报告基因的真核细胞是将突变型HIV ILTR和报告基因插入P⑶ΝΑ3.0载体得到的重组质粒转染真核细胞得到的。
[0020]在具体的实施方式中，所述野生型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID Ν0:1所示HIV LTR和Luc报告基因，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ IDNO:2所示HIVLTRA κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO:3所示HIV LTR Λ TARO和Luc报告基因或SEQ IDNO:4所示HIV LTR Λ APl和Luc报告基因。
[0021]在具体的实施方式中，所述真核细胞可稳定传代。
[0022]在具体的实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选人胚胎肾细胞系293细胞。
[0023]在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述真核细胞系统的方法，所述方法包括以下步骤:
[0024](a)构建包含野生型HIV ILTR和报告基因的重组质粒和/或包含突变型HIVILTR和报告基因的重组质粒；
[0025](b)利用(a)所述的重组质粒分别转染真核细胞；和
[0026](c)筛选、挑出整合有所述重组质粒并稳定表达所述报告基因的单克隆细胞株并发育成相应细胞系。
[0027]在具体的实施方式中，所述野生型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID N0:1所示HIV LTR和Luc报告基因，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ IDNO:2所示HIVLTRA κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO:3所示HIV LTR Λ TARO和Luc报告基因或SEQ IDNO:4所示HIV LTR Λ APl和Luc报告基因。[0028]在具体的实施方式中，所述包含野生型HIV ILTR和报告基因的重组质粒是将野生型HIV ILTR和报告基因插入P⑶NA3.0载体得到的，所述包含突变型HIV ILTR和报告基因的重组质粒是将突变型HIV ILTR和报告基因插入P⑶NA3.0载体得到的。
[0029]在具体的实施方式中，所述野生型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID NO:1所示HIV LTR和Luc报告基因，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ IDNO:2所示HIVLTRA κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO:3所示HIV LTR Λ TARO和Luc报告基因或SEQ IDNO:4所示HIV LTR Δ APl和Luc报告基因。
[0030]在具体的实施方式中，所述方法还包括PCR验证的步骤。
[0031]在具体的实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选人胚胎肾细胞系293细胞。
[0032]在第三方面，本发明提供第一方面所述的真核细胞系统在筛选HIV-1治疗药物中的用途。
[0033]在具体的实施方式中，所述HIV-1治疗药物是HIV-1表达激活剂。
[0034]在第四方面，本发明提供一种筛选HIV I表达激活剂的方法，所述方法包括以下步骤:
[0035](a)将待测物质施用于第一方面所述真核细胞系统中(a)所述的真核细胞；
[0036]和
[0037](b)检测所述真核细胞中报告基因的表达情况；
[0038]如果与所述待测物质施 用前所述报告基因的表达情况相比，所述报告基因的表达增强，则所述待测物质是HIV I表达激活剂。
[0039]在第五方面，本发明提供一种质粒，所述质粒包含野生型HIV ILTR和报告基因，或突变型HIV ILTR和报告基因。
[0040]在具体的实施方式中，所述野生型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID N0:1所示HIV LTR和Luc报告基因，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ IDNO:2所示HIVLTRA κ B和Luc报告基因、SEQ ID NO:3所示HIV LTR Λ TARO和Luc报告基因或SEQ IDNO:4所示HIV LTR Λ APl和Luc报告基因。
[0041]在具体的实施方式中，所述质粒是将野生型HIV ILTR和报告基因或突变型HIVILTR和报告基因插入P⑶ΝΑ3.0载体得到的；优选地，所述野生型HIV1LTR和报告基因包括SEQ ID NO:1所示HIV LTR和Luc报告基因，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ IDNO:2 所示 HIV LTRA κ B 和 Luc 报告基因、SEQ ID NO:3 所示 HIV LTR Δ TARO 和 Luc 报告基因或SEQ ID NO:4所示HIVLTR Λ APl和Luc报告基因。
[0042]在第六方面，本发明提供一种真核细胞，所述真核细胞整合有突变型HIV ILTR和报告基因，从而稳定表达整合的所述报告基因。
[0043]在具体的实施方式中，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID NO:2所示HIV LTRA κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO:3所示HIV LTR Δ TARO和Luc报告基因或SEQID NO:4所示HIV LTR Λ APl和Luc报告基因。
[0044]在具体的实施方式中，所述真核细胞是将突变型HIV ILTR和报告基因插入P⑶ΝΑ3.0载体得到的重组质粒转染真核细胞得到的；优选地，所述突变型HIV ILTR和报告基因包括SEQ ID NO:2所示HIV LTRA κ B和Luc报告基因，SEQ ID NO:3所示HIVLTR Δ TARO和Luc报告基因或SEQ ID NO:4所示HIVLTR Λ APl和Luc报告基因。
[0045]在具体的实施方式中，所述真核细胞能稳定传代。
[0046]在具体的实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选人胚胎肾细胞系293细胞。
[0047]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0048]图1以pcDNA3.0-HIV LTR-Luc质粒为例说明了重组质粒的构建思路。
[0049]图2显示了 293-HIV LTR[Luc]系列细胞系的PCR验证结果。从左到右分别为 293-HIV LTR-Luc,293-HIV LTRA κ B-Luc,293-HIV LTR Δ TAR-Luc 和293-HIVLTR Λ APl-Luc 的基因组 DNA 的 PCR 结果。
[0050]图3显示了冷光仪检测TNF- α激活前后293_LTR[Luc]系列细胞系中Luc表达水平的变化情况:左边为未加药组，右边为加药组。纵坐标表示加药组与未加药组荧光素酶表达水平的比值。
【具体实施方式】
[0051]发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用HIV-1LTR上特定顺式元件突变报告质粒转染真核细胞获得的细胞系，能够建立传代非常稳定的、野生型LTR和顺式元件突变的LTR细胞模型。由于所述细胞模型传代稳定，因此不同批次实验之间误差非常低，因而特别适合用于药物筛选与信号通路机制研究。在此基础上完成了本发明。
[0052]细胞模型
[0053]本发明所用的术语“细胞模型”指用于药物筛选以及研究药物影响HIV基因表达所涉及的信号通路的一套真核细胞检测系统。
[0054]在具体的实施方式中，本发明的细胞模型包括具有包含野生型HIV ILTR和报告基因的重组报告质粒的真核细胞；和具有包含突变型HIV ILTR和报告基因的重组报告质粒的真核细胞。
[0055]在具体的实施方式中，本发明的细胞模型包含HIV-1LTR上特定顺式元件突变的报告质粒(即 pcDNA3.0-HIV LTR-Luc、pcDNA3.0-HIV LTRA κ B-Luc、pcDNA3.0-HIVLTR Δ TAR-Luc 和 pcDNA3.0-HIV LTR Δ APl-Luc 四种质粒，统称为 LTRLuc-neo 重组质粒)。在一优选的实施方式中，所述真核细胞是人胚胎肾细胞293细胞系。
[0056]本发明提出的LTR上重要顺式元件突变的荧光素酶稳定表达真核细胞系统，是由转染人胚胎肾细胞293细胞系(美国模式培养物保藏中心(ATCC，R0ckville，MD)，然后用新霉素G418筛选，挑选出单克隆细胞，培育成293-HIVLTR[Luc]系列细胞系(即包括293-HIVLTR-Luc、293-HIV LTRA κ B-Luc,293-HIV LTR Λ TAR-Luc和 293-HIV LTRA APl-Luc这四种细胞模型);其中，LTRLuc-neo重组质粒是利用pCDNA3.0为载体，通过Nde I和Xho I (或No11)酶切后，顺序插入PCR后双酶切的LTR-Luc片段(即分别为HIV LTR-Luc，HIVLTR Λ κ B-Luc,HIV LTR Λ TARO-Luc 和 HIV LTR Δ APl-Luc )0 其结构见图1 所示。在 293-HIV LTR [Luc]系列细胞系中，野生型LTR可以用来筛选能够激活下游Luc基因表达的药物；而特定顺式元件突变，会造成相应的信号通路对LTR下游的Luc基因的表达不再产生影响，从而可以用以分析该药物对LTR调控作用产生影响的相关机制。
[0057]真核细胞
[0058]本发明所用的术语“真核细胞”具有本领域普通技术人员熟知的含义，即，含有真核(被核膜包围的核)的细胞。在优选的实施方式中，本发明所用的真核细胞是哺乳动物细胞。在另一优选的实施方式中，本发明所用的真核细胞是人细胞。在更优选的实施方式中，本发明所用的真核细胞是人胚胎肾细胞293细胞系。
[0059]报告基因
[0060]本发明所用的术语“报告基因”具有本领域普通技术人员熟知的含义，即，编码可被检测的蛋白质或酶的基因，换言之，其表达产物非常容易被鉴定的基因，例如LacZ。在具体的实施方式中，本发明所用的报告基因是荧光素酶报告基因。
[0061]顺式元件
[0062]本发明所用 的术语“顺式元件”具有本领域普通技术人员熟知的含义，即，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。顺式元件的作用是参与基因表达的调控，其本身不编码任何蛋白质，仅仅提供作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。
[0063]HIV-1LTR 顺式元件
[0064]本发明所用的术语“HIV-1LTR顺式元件”指HIV-1基因组中LTR区存在的各种结合位点。
[0065]HIV-1治疗药物
[0066]本发明所用的术语“HIV-1治疗药物”泛指对HIV-1治疗有益的药物，包括能够激活潜伏HIV-1表达，从而可以利用其它药物杀伤活跃的HIV-1的药物。
[0067]HIV-1表达激活剂
[0068]本发明所用的术语“HIV-1表达激活剂”指能够激活潜伏HIV-1表达的物质。
[0069]瞬时转染与稳定转染
[0070]常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。而稳定转染是指外源DNA/RNA转染真核细胞后整合到宿主染色体中，因此，外源基因能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代。
[0071]然而，稳定转染存在着诸多困难之处。首先，稳定转染的操作难度大，外源基因进入培养细胞一般要经过几天才能够整合入基因组DNA。其次，在稳定转染中，外源基因往往随机整合到宿主染色体上，那么所得细胞对于外源基因的表达情况可能非常复杂，整合位点不同可能造成外源基因表达或不表达，表达水平可能很高或很低。因此，稳定转染的成功受到许多因素的影响，例如所采用的具体载体、筛选条件等等，得到阳性克隆的难度大。而且由于外源基因的表达还与整合在染色体中的位置相关，因而还需要对所得克隆进行验证，这使得筛选难度增大，失败的可能性高。
[0072]在具体的实施方式中，本发明利用新霉素作为筛选条件。在优选的实施方式中，所述新霉素的使用浓度是600-1000 μ g/ml。在更优选的实施方式中，所述新霉素的使用浓度是700-90(^8/1111。在最优选的实施方式中，所述新霉素的使用浓度是800 μ g/ml。
[0073]本发明的通用方法
[0074]HIV的LTR片段有许多与HIV基因组上基因表达相关的调控元件，当细胞中相应的转录因子与之结合时，LTR下游的基因的表达水平会得到增强或抑制。而通过对上述转录因子结合位点进行突变后，这些转录因子就不能对LTR下游相关基因的表达起到作用，因而可以对药物的作用机理进行研究。根据上述原理，本发明构建了包含野生型LTR-报告基因重组质粒和LTR特定转录因子识别位点突变的LTR-报告基因重组质粒。
[0075]1.重组质粒的构建
[0076]对于用于构建重组质粒的各元件，可以采用常规方法如PCR方法(参见《分子克隆指南》，2005年第三版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)从相关质粒中扩增出相应的元件(包括LTR元件、报告基因片段等)，然后进行酶切，连接并插入合适载体的相应位置。
[0077]此外，也可以采用人工全合成的方法合成相应元件、片段或质粒。
[0078]2.真核细胞系统的建立
[0079]利用构建的LTR-报告基因重组质粒，采用常规方法(《分子克隆指南》，2005年第三版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)转染真核细胞，然后经筛选、挑选出单克隆细胞，培育成细胞系。在相应激活剂的作用下，这些细胞系中的报告基因的表达水平会产生不同变化。
[0080]在优选的实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在更优选的实施方式中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在还要优选的实施方式中，所述人细胞是人胚胎肾细胞293。
`[0081]本发明的优点
[0082]1.本发明的真核细胞系统为稳定表达细胞株，与现有的瞬时转染系统相比实验结果重复性高，可以传代培养使用；
[0083]2.本发明的真核细胞系统在不同批次实验之间误差低；
[0084]3.本发明的真核细胞系统可以用冷光仪检测荧光素酶的表达，因而该系统操作简便、步骤少、灵敏度高、且易于定量，是用于HIV-1药物筛选相关的高效实用的定量评估系统。
[0085]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明的具体条件通常按照常规条件，例如《分子克隆指南》(2005年第三版，萨姆布鲁克等著，科学出版社)，又如《细胞实验指南》(2003年，斯佩克特等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0086]实施例1.构建LTRLuc-neo重组质粒
[0087]1.LTR-报告基因片段的制备
[0088]用人工合成的方法，先合成HIV LTR(SEQ ID NO:1，野生型LTR)、HIVLTRΛ κ B (SEQID NO:2，特定顺式元件突变的LTR)、HIV LTR ATARO (SEQ IDNO:3，特定顺式元件突变的LTR)和HIV LTR AAPKSEQ ID NO:4，特定顺式元件突变的LTR)片段；再将上述各合成片段分别与PCR扩增的全长Luc报告基因(野生型，SEQ ID N0.:5)进行连接，从而得到HIVLTR-Luc, HIVLTRA k B-Luc, HIV LTR Λ TARO-Luc 和 HIV LTR Λ APl-Luc 片段。
[0089]SEQ ID NO:1(野生型 LTR) -TGGAAGGGCTAATTTGGTCCCAAAAAAGACCAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTG