专利名称：Hiv-1/hiv-2通用探针及引物pcr检测技术的制作方法
该技术选用了针对HIV-1及HIV-2各亚型特异、通用的引物及分子信标探针，通过检测各种HIV标准血清及临床血清，确定其检测HIV的各种检测指标特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％、HIV检测的最低含量为50拷贝/ml，证实所采用的通用引物及通用荧光探针具有很好的敏感性、特异性及重复性。1、样本处理及反转录cDNA链合成300μl血清+120μl RNA裂解液，振荡10S；混匀冰浴5min；420μl酚抽提一次，振荡20S，12000r/min离心1min；上清加350μl异丙醇，室温5min；500μl 75％乙醇洗涤沉淀，吸水纸洗干，37℃晾干10min，备用(如需保存RNA，则加入DEPC处理水，-20℃保存)。加入9μl逆转录反应液及1μl AMV酶，12000r/min离心10S，42℃水浴45min。2、探针标记荧光分子信标探针序列的5’端及3’端分别用FAM及DABCYL标记。3、PCR扩增取Taq酶1U加入反应液管内(反应液1.0μM正义引物，1.0μM反义引物，1.0μM荧光分子信标探针，1.5mM Mg2+，50mM Tris，50mM KCl)，然后将样本、阴性对照或阳性对照的反转录液各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000r/min离心10s上机扩增(同时设空白对照一管空白对照只需在反应液管内加Taq酶1U、去离子水5μl混匀后10000r/min离心10s上机扩增)。扩增程序94℃预变性5min，循环条件94℃ 30S，60℃ 65S，共40个循环；60℃延伸7min，最后28℃保温3min。4、荧光检测待各PCR反应液管降至28℃后迅速放入荧光检测仪，读取并记录荧光值，荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。5、结果分析①荧光值确定Ax＝样本或各对照管荧光值-空白对照管荧光值 ②实验有效性判别阴性对照值Ax值(An)小于10时按10计算；阴性对照值大于20则本次实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。
③结果判定在实验有效的情况下样本Ax≥An×2.5判为阳性；Ax≤An×2.1判为阴性；An×2.1＜Ax＜An×2.5为实验灰区，需重复实验一次，若重复实验结果样本Ax≥An×2.1判为阳性，否则判为阴性。


人类免疫缺陷病毒(HIV)通用探针及引物PCR检测技术是体外生物诊断的一部分。该技术选用了针对HIV－1及HIV－2各亚型的通用正义引物、通用反义引物及通用分子信标探针，并用荧光分子信标探针PCR检测技术。该探针5’标记FAM，3’标记DABCYL。由该方法组成的检测试剂盒对各种HIV亚型标准血清及临床血清，获得该试剂盒用于HIV－1/HIV－2检测的各种参数为特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％、HIV检测的最低含量为50拷贝/ml。本发明还详述了荧光分子信标的基本原则及HIV荧光分子信标PCR检测技术的具体方法。