一种植物来源活性成分－纳米级膜性囊泡的制备方法[0002]膜性囊泡(exosomes)是一种可由多种细胞分泌的直径约为30_100nm双层膜结构的杯状小囊泡。Exosomes能在细胞间传递蛋白、mRNA、microRNA等活性物质,参与许多重要的生理、病理过程，其独特作用受到越来越多关注。[0003]目前exosomes主要从细胞培养上清、肿瘤组织的渗出液等材料中获取，分离方法主要有滤膜过滤法，超速离心法，蔗糖密度梯度离心法。从细胞培养上清等来源中获取exosome,材料来源有限,材料成本较高，所获得的exosomes含量很低,提纯后的exosomes成本更高，这就制约了 exosomes的大规模工业化生产和临床应用。因此,探索从来源丰富的原料中提取exosomes,使其能够实现较低的生产成本及较高的产量,对于exosomes的大规模应用具有重要意义。[0004]多汁性植物中富含exosomes和纳米级膜性囊泡(exosome_likenanoparticles),其携带的各种有效成分赋予植物来源exosomes和纳米级膜性囊泡多种强大的生物学功能，使之能够成为保健食品和治疗性药物的重要来源。
[0005]本发明的目的是提供一种原料来源丰富、生产成本较低，可大量生产的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡(exosome-like nanoparticles)的制备方法。[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案是:一种植物来源活性成分一纳米级膜性囊泡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤: (O植物原料原液的提取:将植物原料榨出汁液；
(2)上清液或浓缩液的提取:将榨出的液体离心后收集上清液，或超滤提取浓缩液；
(3)膜性囊泡的沉淀和重悬:将所述上清液或超滤浓缩液离心后收集沉淀，再将所得沉淀重新悬浮后获得膜性囊泡重悬液；
(4)纳米级均质处理:膜性囊泡重悬液经纳米级均质化，获得纳米级颗粒，即植物来源活性成分纳米级膜性囊泡。
[0007]优选的，所述上清液的提取步骤为:将榨出的液体以1000~4000转/分钟(RCF:9(Tl500Xg)离心5~40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液2000~8000转/分钟(RCF:30(T6000Xg)离心10~50分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000~50000转/分钟(RCF:3000^240000 Xg)离心0.5~2小时，弃沉淀，收集上清。
[0008]优选的，所述浓缩液的提取步骤为:将所述植物榨出汁液用10-12500目过滤材料过滤除去残渣，收集滤过的液体；滤过液体采用0.1-0.5 μ m微滤膜过滤，收集微滤过的液体；再将微滤过的液体采用0.01~0.05 μ m超滤膜超滤，弃滤过液，收集富含膜性囊泡的浓缩液。
[0009]优选的，所述浓缩液提取中的过滤步骤为采用至少一种网孔直径的过滤材料，按照网孔直径由大到小依次过滤。
[0010]优选的，所述过滤材料为10~12500目滤网、0.1~0.5 μ m微滤膜和0.01~0.05 μ m
超滤膜中的一种或数种。
[0011]优选的，所述膜性囊泡的沉淀和重新悬浮步骤为:将所述上清液或浓缩液以20000~200000转/分钟(RCF:150000~4000000Xg)离心0.1~3小时收集沉淀，再以生理盐水或者磷酸缓冲液(PBS)重新悬浮膜性囊泡沉淀。
[0012]优选的，所述纳米级均质化步骤为:将经重悬处理后的膜性囊泡采用超高压均质机均质化或者振荡机振荡均质化处理获得纳米级颗粒，即植物来源活性成分纳米级膜性囊泡。
[0013]优选的，所述植物原料原液的提取、上清液或浓缩液的提取都在0-37摄氏度环境中进行。
[0014]优选的，所述植物原料为多汁性植物。
[0015]优选的，所述植物原料包括:葡萄、黄瓜、西瓜、西红柿、草莓、蓝莓、樱桃、苦瓜、马齿苋、人参、党参、太子参、西洋参、丹参、白芷、前胡、牛膝、射干、虎杖、商陆、葛根、土伏苓、玄参、红率、山药、黄精、黄苗、大蒜、桑椹子、枸杞子、生姜、蒸枝、龙眼、仙灵脾、薄荷、柴胡、蒲公英、芦根、金银花、连翘、穿心莲、鱼腥草、大黄、芦荟、番泻叶、五味子、天麻、石斛或更多多汁性植物。
[0016]本发明还提供一种植物来源活性成分一不同密度纳米粒子的制备方法，将所述均质处理后的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡采用密度梯度离心，得到不同密度的样品条带，然后收集这些条带用生理盐水或磷酸缓冲液稀释，再以6000-200000转/分钟(RCF:3000^4000000 X g)离心，收集沉淀，生理盐水或磷酸缓冲液重悬沉淀,超高压均质机均质化或者振荡机振荡均质化，就可得到不同密度的纳米粒子。
[0017]优选的，所述密度梯度离心是以蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为梯度材料，所述密度梯度为8%、30%、45%、60%或更多不同浓度的所述梯度材料溶液。
[0018]优选的，所述密度梯度的离心转速是6000-50000转/分钟，离心时间为0.1~3小时。
[0019]本发明采用植物原料制备纳米级膜性囊泡，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用纳米膜性囊泡成为现实。

[0020]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0021]实施例1
(I)清水洗净的黄瓜在20摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
[0022](2)榨出的汁液经10目、100目、600目滤网按网眼直径从大到小依次过滤(在37摄氏度环境中操作)，收集过滤的液体。
[0023](3)将收集的液体以1000转/分钟离心40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液2000转/分钟离心50分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000转/分钟离心2小时弃沉淀，收集上清。上清液20000转/分钟离心3小时收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到膜性囊泡重悬液。
[0024](4)膜性囊泡重悬液用纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒，即纳米膜性囊泡。
[0025](5)分装样品，纳米膜性囊泡可在_80°C低温冰箱长期保存 实施例2
(I)清水洗净的丹参在8摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
[0026](2)榨出的汁液经800目、1200目滤网依次过滤(在20摄氏度环境中操作)，收集过滤的液体。
[0027](3)将收集的液体以2000转/分钟20分钟，弃沉淀，收集上清；上清液4000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，收集上清；上清液10000转/分钟离心I小时弃沉淀，收集上清。上清液30000转/分钟离心I小时收集沉淀，用生理盐水重悬沉淀得到膜性囊泡重悬液。
[0028](4)膜性囊泡重悬液用纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒。
[0029](5)分装样品，纳米膜性囊泡可在_80°C低温冰箱长期保存。
[0030]实施例3
(I)清水洗净的大蒜在4摄氏度环境中榨出汁液。
[0031](2)榨出的汁液经12500目滤网过滤(在10摄氏度环境中操作)，收集过滤的液体。
[0032](3)将收集的液体以3000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000转/分钟离心40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液30000转/分钟离心I小时弃沉淀，收集上清。上清液40000转/分钟离心I小时收集沉淀，用生理盐水重悬沉淀得到膜性囊泡重悬液。
[0033](4)膜性囊泡重悬液用振荡机振荡均质化处理获得纳米膜性囊泡。
[0034](5)分装样品，纳米膜性囊泡可在_80°C低温冰箱长期保存。
[0035]实施例4
I)清水洗净的芦荟在10摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
[0036](2)榨出的汁液经6000目、10000目滤网依次过滤(在25摄氏度环境中操作)，收集过滤的液体。
[0037](3)将收集的液体以4000转/分钟离心5分钟，弃沉淀，收集上清；上清液8000转/分钟离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清液50000转/分钟离心0.5小时弃沉淀，收集上清。上清液100000转/分钟离心0.1小时收集沉淀，磷酸缓冲液重悬沉淀得到膜性囊泡重悬液。
[0038](4)膜性囊泡重悬液经纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒，即纳米膜性囊泡。
[0039](5)分装样品，纳米膜性囊泡可在_80°C低温冰箱长期保存。
[0040]以上实施例中所述植物原料可以是葡萄、黄瓜、西瓜、西红柿、草莓、蓝莓、樱桃、苦瓜、马齿觅、人参、党参、太子参、西洋参、丹参、白]E、前胡、牛膝、射干、虎杖、商陆、葛根、土伏苓、玄参、红枣、山药、黄精、黄芪、大蒜、桑椹子、枸杞子、生姜、荔枝、龙眼、仙灵脾、薄荷、柴胡、蒲公英、芦根、金银花、连翘、穿心莲、鱼腥草、大黄、芦荟、番泻叶、五味子、天麻、石斛或更多多汁性植物实施例5
用按照本发明方法所制备的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡(即纳米粒子)，在离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，采用密度梯度为8%、30%、45%,60%的蔗糖溶液，样品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以20000转/分钟超速密度梯度离心3小时，离心后在不同浓度蔗糖溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，用生理盐水稀释后120000转/分钟离心，收集沉淀，用生理盐水重悬，再经超高压均质机均质化，即得到不同密度的纳米囊泡(纳米粒子)。
[0041]实施例6
用按照本发明方法所制备的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡(即纳米粒子)，在离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，采用密度梯度为8%、30%、45%,60%的蔗糖溶液，样品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以30000转/分钟超速密度梯度离心2小时，离心后在不同浓度蔗糖溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，用磷酸缓冲液稀释后6000转/分钟离心，收集沉淀，磷酸缓冲液重悬沉淀，经振荡机振荡均质化，即得到不同密度的纳米囊泡(纳米粒子)。
[0042]实施例7
用按照本发明方法所制备的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡(即纳米粒子)，在离心管中依次加入不同浓度的氯化铯溶液，采用密度梯度为10%、20%、30%、40%的氯化铯溶液，样品置于氯化铯密度梯度溶液表面，然后以40000转/分钟超速密度梯度离心I小时，离心后在不同浓度氯化铯溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，生理盐水或磷酸缓冲液稀释后40000转/分钟离心，收集沉淀，生理盐水重悬，超高压均质机均质化，即得到不同密度的纳米囊泡(纳米粒子)。
[0043]实施例8
用按照本发明方法所制备的植物来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡(即纳米粒子)，在离心管中依次加入不同浓度的氯化铷溶液，采用密度梯度为10%、20%、40%、60%的氯化铷溶液，样品置于氯化铷密度梯度溶液表面，然后以50000转/分钟超速密度梯度离心0.1小时，离心后在不同浓度氯化铷溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，磷酸缓冲液稀释后50000转/分钟离心，收集沉淀，磷酸缓冲液重悬，振荡机振荡均质化，即得到不同密度的纳米囊泡(纳米粒子)。
[0044]实施例5~8中的密度梯度可以是蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为梯度材料。
[0045] 离心转速不限于实施例中的所提到的具体数值，可以在权利要求和
中所指出的相应转速范围内任意变化。
[0046]本发明采用植物原料制备纳米级膜性囊泡，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用膜性囊泡成为现实。
[0047]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。