专利名称：培育蛹虫草抗退化菌种的方法蛹虫草子实体[Cordyceps militaris]又称北冬虫夏草子实体或子座,简称北虫草，子囊菌亚门，麦角菌科，虫草属。近年来人工培养子实体遍及城乡，已成为我国的一个新兴产业。但无论是专业人员还是专业公司，在栽培实践中往往出现只长菌丝不长草(子实体)、不转色，或草的产量低、质量差等问题。有效成份含量极少且不稳定，不但难以实现标准化生产，甚至使众多生产者绝收破产。究其原因，主要是菌种退化，菌种不能继代使用。菌种往往只能使用一次，勉强继代使用也不超过两代。众多技术人员为防止菌种退化，用尽了各种传统的制种办法，如组织分离优选部位、孢子分离选优、提纯复壮、引进优种、杂交选优等，但始终阻止不了菌种的快速退化。尽管诸多专家学者发表了不少论文意见，但理论要变成实践意义上的生产力尚需要漫长的时间。蛹虫草菌种的快速退化，已成为该产业发展的瓶颈。对广大生产者来说，菌种快速退化问题亟待解决。本发明就是在多年的生产实践中总结出来的简便易行的有效方法。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种培育蛹虫草抗退化菌种的方法，所得到的蛹虫草抗退化菌种，可连续十次继代使用。本发明的技术方案为一种培育蛹虫草抗退化菌种的方法，包括下列步骤(I)培养优胜种制备有伴生菌生长的蛹虫草母种管，PDA培养基+氯霉素，先斜面接种伴生菌拟青霉或被毛孢菌种，进行培养，再接入蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种(Cordyceps militaris)保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日2011年12月12日，保藏号=CGMCC No. 5577，继续进行培养，使蛹虫草生长旺盛并全部吞没伴生菌，得到蛹虫草种优胜种；(2)将优胜种管置于O _20°C的环境中培养不少于30天，然后将其置于18 25°C条件下恢复生长3 5天；(3)将恢复后的优胜种管去掉管塞，置于15 25°C的杂菌环境中培养5 7天；然后再盖上管塞将其置于28 36°C的杂菌环境中培养5 7天；或先将恢复后的优胜种管置于28 36°C的杂菌环境中培养5 7天；然后再去掉管塞置于15 25°C的杂菌环境中培养5 7天；(4)经上述(I) (3)步骤培养后，试管菌种变色，杂菌生长，其中有少量具有生命活力的蛹虫草菌丝，将其分离于PDA培养基上，置于18 25°C条件下培养6 8天后，按制种常规提纯复壮，得到蛹虫草抗退化菌种。优选的是，上述培养优胜种的具体步骤为制备伴生菌管多只，PDA培养基+氯霉素，45ug/1000ml,管斜面中间接O. 8 2mm拟青霉或被毛孢种一块为伴生菌，置于10 18°C条件下培养7 10天，待菌种定植并长开时，在斜面两端距伴生菌Icm之外，分别接入蛹虫草菌种2 5_各一块，将菌管置于18 20°C条件下培养3 5天后,待蛹虫草菌种定植并散开生长之时，将培养温度提高到24 26°C，3 5天后蛹虫草生长旺盛，并全部吞没了伴生菌，得到蛹虫草种优胜种。适应性培养是本技术的主要特征，即制备有低温伴生菌生长的蛹虫草母种管，置于低温、高温、缺氧及杂菌生长的环境中培养菌种，经培养后的母种再提纯复壮，得到蛹虫草抗退化菌种，然后再进入原种和栽培种的应用阶段。实践证实，抗退化菌种用于栽培中，连续十次继代使用不会退化 ，生物转化率在70%左右，得到的蛹虫草子实体，表现为色泽深金黄，保持原始特性，正常培养工艺范围内各项指标稳定，经检测其有效成份，虫草素含量不少于O. I %，腺苷含量不少于O. 055%,多糖含量不少于2. 5%，符合《中华人民共和国卫生部公告2009年第3号》关于批准蛹虫草为新资源食品的公告规定的指标。I. 3将恢复生长后的菌种分为A、B两组，再将各组分为10小组，每小组3只。A组去掉试管塞，10小组分别置于不同的室内的不同纸箱中，箱内放两个生了霉菌的平菇废菌包。室温为18 24°C ;同时将B组的10小组分别用塑料布包住，置于田地里不同位置的20cm深的土坑内，分别用土埋好，地温为28 32°C ;A、B两组各培养5天后，A组加盖管塞，B组去掉管塞，交换环境，按前法同样培养5天。I. 4经过上述培养后的菌种均已变色，红霉、绿霉、杂菌丛生。原蛹虫草菌种多数死亡，但每只试管中均有一些有活力的蛹虫草菌丝；将这些有活力的菌丝细心地分离到PDA培养基上，在18 25°C的恒温箱中培养7天后，进行提纯复壮。共计得到55只优质蛹虫草抗退化菌种管，可进入原种和栽培种的制作和应用阶段。通过上述实施例I 20得到的菌种，用于栽培中，连续十次继代使用，生物转化率为68 71 %。得到的蛹虫草子实体，表现色深金黄，高度4 6厘米，直径3 4毫米，子囊果粗壮，保持原始特性。经检测其有效成份，虫草素含量在O. I O. 15%之间，腺苷含量在O. 055 O. I %之间，多糖含量在2. 5 17. 6%之间，符合卫生部2009年第三号公告的标准。实施例21 40冬季，中国被毛抱(Hirsutella sinensis)伴生2. I制备伴生菌管60只，用PDA培养基+氯霉素45ug/1000ml。每只斜面管中间接中国被毛孢菌种2mm—块，置于10 18°C恒温箱中培养10天后，中国被毛孢种定植并散开生长；此时，在斜面菌管两端距被毛孢种Icm之外，分别接一块5mm大的蛹虫草菌种各一块，所述蛹虫草菌种保藏号为CGMCC No. 5577，置于10 20°C的恒温箱中培养4天后，蛹虫草种长开，此时，将培养温度提高到24 26°C，5天后蛹虫草种生长旺盛，全部吞没了被毛孢，标志着蛹虫草种为“优胜种”。2. 2将60只“优胜种”管平均分为A、B两组，分别装入两个箱中，置于室外0°C以下的阳面墙下，放置30天后，将A、B两组再置于18 25°C恒温箱中恢复生长3天。2. 3将恢复生长后的A组去掉试管塞，分成10小组，每小组3只，分别置于不同的纸箱内，每个箱中放I 3个生了霉菌的平菇废菌包，把纸箱置于蔬菜大棚中的不同位置的阴暗处，温度18 21°C ;同时将B组分成10小组，每小组3只，分别用塑料布包住置于室内的火炕上，保持在28 30°C ;A、B两组各自培养7天后，A组加盖管塞，B组去掉管塞，交换环境，按前法同样培养7天。2. 4经过上述培养后的60只菌种管全部变了色，红霉、绿霉、杂菌丛生，原蛹虫草菌种多数死亡，但每管中均有一些有生命活力的蛹虫草菌丝，将这些有活力的菌丝细心地分离到PDA培养基上，在18 25°C的恒温箱中培养7天后，进行提纯复壮。共计得到50只优质蛹虫草抗退化菌种管，可进入原种和栽培种的制作和应用阶段。通过上述实施例21 40得到的菌种，用于栽培中，连续十次继代使用，生物转化 率为68 71%。得到的蛹虫草子实体，表现色深金黄，高度4 6厘米，直径3 4毫米，子囊果粗壮，保持原始特性。经检测其有效成份，虫草素含量在O. I O. 15%之间，腺苷含量在O. 055 O. I %之间，多糖含量在2. 5 17. 6%之间，符合卫生部2009年第三号公告的标准。

本发明提供一种培育蛹虫草抗退化菌种的方法，所述方法包括制备有低温伴生菌生长的蛹虫草母种管，置于低温、高温、缺氧及杂菌生长的环境中培养菌种，经培养后的母种再提纯复壮，得到蛹虫草抗退化菌种，然后再进入原种和栽培种的应用阶段。抗退化菌种用于栽培中，连续十次继代使用，生物转化率70％左右，得到的蛹虫草子实体，表现为色泽深金黄，保持原始特性，正常培养工艺范围内各项指标稳定，经检测其有效成份，虫草素含量不少于0.1％，腺苷含量不少于0.055％，多糖含量不少于2.5％，符合《中华人民共和国卫生部公告2009年第3号》关于批准蛹虫草为新资源食品的公告规定的指标。