生物固相酶催化合成l-茶氨酸的生产工艺制作方法

周丙午, 周兴华, 范永军

2012年7月4日

2012年1月11日

2012年1月11日

广东乐尔康生物科技股份有限公司

C12N15/60GK102533886SQ20121000662

固相 氨酸 催化 合成 生物

1.一种生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生产工艺，包括如下步骤和工艺条件(1)生物合成将底物与固相酶催化合成生成L-茶氨酸溶液，再通过离心与生物固相酶分离，所述底物为谷氨酸钠、六水氯化镁、六偏磷酸钠、盐酸乙胺及三磷酸腺苷，底物摩尔浓度比例为谷氨酸钠10 lOOmmorl，六水氯化镁10 IOOmmorl，六偏磷酸钠10 lOOmmorl，盐酸乙胺10 IOOmmorl及三磷酸腺苷10 lOOmmorl，底物与固相酶的配比为 Imorl谷氨酸钠配100 1000KU生物效价单位的固相酶；(2)分离纯化生成的L-茶氨酸溶液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的阴离子，再分步洗脱除去阳离子，最后稀氨水洗脱置换游离出L-茶氨酸；(3)脱色浓缩茶氨酸水溶液活性炭脱色后，赶氨，真空薄膜浓缩得纯L-茶氨酸浓溶液；(4)结晶干燥向L-茶氨酸浓溶液加入95%酒精，于0 40°C搅拌，析出L-茶氨酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色L-茶氨酸粉末2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的合成的底物溶液PH值6.5 103.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的生物合成反应温度25 55 °C4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的L-茶氨酸浓溶液与95%酒精的体积比为15 105.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于所述固相酶由如下工艺制备(A)茶氨酸合成酶的基因克隆及表达根据专性亲甲基醇菌 Methylovorus mays No. 9 (Biosci. Biotechnol. Biochem. 72 (1)，101-109, 2008)的茶氨酸合成酶的基因序列，设计一对引物 5’-GAAGGAGATCATATGAAGTCACTG-3‘和 5’-CTAGGATCCTTAGTAAAACTGTACGTAG CGATTGATTTCC -3，，两对引物各含有内切酶NdeI和BamHI序列，根据Bio-Rad公司iProof多聚酶的说明书扩增基因，其中DNA模板为专性亲甲基醇菌Methylovorus mays No. 9的基因组DNA，用内切酶NdeI和BamHI消化扩增片段，然后连接到载体pREST-lac上，得到茶氨酸合成酶表达型质粒 pREST-lac-GS ；该质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液，成份为16克胰蛋白胨，10克酵母粉，5克氯化钠，37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体；(B)酶的纯化与固定化取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液(20mM，pH7. 4)悬浮，800bar高压破碎，加5M磷酸盐溶液(PH8. 0)至终浓度为1. 2M，缓慢搅拌下加适量1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量；以每15mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体，室温缓慢搅拌M小时， 弃上清，所得固相酶分别以20mM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)、含IM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)及20mM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)洗涤，最后，测定固相酶的活性

本发明涉及一种生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生产工艺，属于生物合成技术领域