专利名称：玉米赤霉烯酮的微生物降解方法玉米赤霉烯酮(Zearalenone ^N)，其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌株，如禾谷镰刀菌(F. graminearum)和三线镰刀菌(F. tricinctum)；其广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶制品中。饲料和食品生产中所用到的谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节中，都有可能受到ZEN的污染。由于玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，可作用于生殖系统，使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症；如果妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎。2009年奥特奇对我国的谷物原料的调查报告显示，玉米赤霉烯酮的检出率为88. 7%，最大值7772. 3ppb，远远超出了我国饲料的限量标准。市场上对于^N的去除方法主要包括有物理方法、化学方法及生物方法。近年来，采用微生物的方法控制食物链中的真菌毒素己被科学界所关注，包括微生物菌体吸附和微生物将毒素代谢为无毒产物，而后者正是目前的研究重点。对ZEN微生物降解的研究通常采用体外模拟动物胃肠道环境的方法，即37°C，在胃酸环境pH为2. 0 2. 5，培养1 2h ；前段肠道酸碱环境pH为6. 5 7. 0，培养3 4h。通过在微生物培养体系中添加一定量的ZEN标准品，培养结束后测定上清液中ZEN含量变化，确定微生物是否能转化或代谢ZEN。也有报道称通过增加对微生物菌体的洗涤次数可以有效降低毒素的吸附量，并且使用有机溶剂处理培养的微生物菌体后，几乎都能将与微生物结合的毒素释放出来，这些方法都为科学鉴定微生物降解毒素的效果提供了一定的依据(Carolyn A h，HaniS Ε,Pasi E K，et al· Surface binding of aflatoxin Bl by lacticacid bacteria. Applied and Environmental Microbiology，2001，67(7) :3086-3091)。但在用微生物降解^NW研究中，筛选出高效的降解菌一直是研究的热点之一。
本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮的微生物降解方法，即用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉来降解^N，通过在体外模拟动物胃肠道环境下测定蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉对ZEN标准品和发霉玉米中ZEN的降解效果，确定其对ZEN的降解条件，为进一步开发ZEN微生物解毒剂奠定了基础。本发明的一个目的是提供一种玉米赤霉烯酮的微生物降解方法，即用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉来降解玉米赤霉烯酮。所述的蜡样芽孢杆菌可选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏号为CGMCC1. 2224。所述的植物乳杆菌可选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏号为CGMCC1. 577。本发明的另一目的是提供一种降解玉米赤霉烯酮的微生物菌粉，所述微生物菌粉为蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌的混合菌粉。所述蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌的混合菌粉，其中蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的重量比为1 1-3。本发明的降解方法可以对发霉谷物中的玉米赤霉烯酮进行降解，具体就是在发霉谷物中加入蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉来降解玉米赤霉烯酮。本发明的降解方法，蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉的添加量的质量百分比为0. 2%，在37°C、pH2. 0条件下降解1. 5h ；或是菌粉的质量百分比为0. 2%，在37°C、pH6. 5条件下降解3. Oh。所述蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌的混合菌粉通过两菌株的协同作用能加强对玉米赤霉烯酮的降解作用，混合菌粉的降解效果明显高于蜡样芽孢杆菌菌粉和植物乳杆菌菌粉单独对玉米赤霉烯酮的降解效果。本发明利用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉对玉米赤霉烯酮进行降解，通过在体外模拟胃肠道环境下分别测定上述菌粉对ZEN的降解效果，摸索出其对ZEN的最佳降解条件，为进一步将其开发为生物解毒剂，用于谷物和饲料中ZEN的降解提供了有力的指导。液中，充分搅拌使其完全溶解。下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。实施例1微生物菌粉的制备1. 1、蜡样芽孢杆菌菌粉的制备1)斜面菌种采用划线法将蜡样芽孢杆菌CGMCC1. 2224接种到营养琼脂培养基，37°C，培养12小时；2)固体种子从斜面保藏菌种接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面，370C，培养12小时；3)种子液的制备将蜡状芽孢杆菌从茄瓶斜面洗下，接种至种子罐，370C，200r/min,培养12h ；培养基配方豆饼粉2.5%，玉米浆2 %，磷酸氢二钠0.1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0. 05% ；4)发酵培养将种子罐的种子液转移到5T发酵罐培养，37°C，150r/min，培养20h ；发酵罐培养基配方豆饼粉2.5%，玉米浆2%，磷酸氢二钠0. 1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0. 05% ；5)压滤向发酵液中添加3%硅藻土，升温到50°C后，进行板框压滤；6)烘干将压滤后的菌泥在沸腾干燥机中干燥，进风口温度90°C，出风口温度50°C，干燥 15s。7)粉碎干燥的菌体颗粒粉碎过40目筛，得到产品。1. 2、植物乳杆菌菌粉的制备1)斜面菌种采用划线法将植物乳杆菌CGMCC1. 577接种到营养琼脂培养基，36°C -37°C，培养14小时；2)固体种子从斜面保藏菌种接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面，360C -370C，培养14小时；3)种子液的制备将植物乳杆菌从茄瓶斜面洗下，接种至种子罐，360C -370C，200r/min,培养14h ；培养基配方豆饼粉2.5%，玉米浆2 %，磷酸氢二钠0.1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0. 05% ；4)发酵培养将种子罐的种子液转移到5T发酵罐培养，370C，150r/min,培养20h ；发酵罐培养基配方豆饼粉2.5%，玉米浆2%，磷酸氢二钠0. 1%，硫酸铵0.05%，硫酸锰0. 05% ；5)压滤向发酵液中添加3%硅藻土，升温到50°C后，进行板框压滤；6)烘干将压滤后的菌泥在沸腾干燥机中干燥，进风口温度90°C，出风口温度50°C，干燥 15s。7)粉碎干燥的菌体颗粒粉碎过40目筛，得到产品。实施例2微生物菌粉对ZEN标准品的降解作用2. 1微生物菌粉降解时间对ZEN标准品降解率的影响根据食糜在动物胃肠中停留时间，分别测定在模拟动物胃、肠道环境下微生物菌粉添加量对ZEN标准品降解率的影响，确定菌粉的最佳添加量。2. 1. 1在模拟胃液中微生物菌粉添加量对ZEN降解率的影响三角瓶中添加灭菌后的pH2. OPBS缓冲液2細1，加入胃蛋白酶溶液0. 25ml，浓度为50ppm 的 ZEN 标准品 0. 25ml，按 0. 05%，0· 10%,0. 15%,0. 2%,0. 3%,0. 4% (质量比)分别加入蜡样芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉及两者的混合菌粉(蜡样芽孢杆菌菌粉和植物乳杆菌菌粉的重量比为1 1)，每组两个重复，37°C，震荡培养4h，培养结束后，4500r/min离心lOmin，上清用漏斗过滤后收集，作为上清中ZEN待测液；沉淀中加入70%甲醇25ml，剧烈震荡5min，过滤收集滤液，作为沉淀解吸附ZEN待测液。测定前于4°C冰箱保存。利用ZEN检测试剂盒测定上清及沉淀中^N含量，并分别计算蜡样芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉及混合菌粉对ZEN的降解率。实验结果见表12. 1. 2在模拟肠液中微生物菌粉添加量对^N降解率的影响三角瓶中添加灭菌后的pH6. 5PBS缓冲液2細1，加入胰蛋白酶溶液0. 25ml，浓度为50ppm 的 ZEN 标准品 0. 25ml，按 0. 05%，0· 10%,0. 15%,0. 2%,0. 3%,0. 4% (质量比)分别加入蜡样芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉及两者的混合菌粉(蜡样芽孢杆菌菌粉和植物乳杆菌菌粉的重量比为1 1)，每组两个重复，37°C，震荡培养他，培养结束后的处理如步骤2. 1. 1中所述。实验结果见表2表1体外模拟胃环境下微生物菌粉添加量对ZEN标准品降解率的影响
本发明涉及一种玉米赤霉烯酮的微生物降解方法，是用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉来降解玉米赤霉烯酮。本发明利用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉对玉米赤霉烯酮进行降解，通过在体外模拟胃肠道环境下分别测定上述菌粉对ZEN的降解效果，摸索出其对ZEN的最佳降解条件，为进一步将其开发为生物解毒剂，用于谷物和饲料中ZEN的降解提供了有力的指导。