专利名称：一种添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法维生素C(即L-抗坏血酸)是人体必需的一种水溶性维生素，动物体内不能自身合成，一般通过食用水果蔬菜获得。维生素C在食品、医药、化工、化妆品、饲料等行业应用广泛。其应用范围在不断拓展，随着人们对营养保健的关注，维生素C的需求将会不断扩大。目前，我国生产维生素C的方法基本沿用了 60年代尹光琳等人发明的“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为大小菌混菌发酵，即使用俗称大菌的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和俗称小菌的酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)混合菌系发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体物2-酮基-L-古龙酸，第一步反应技术相对成熟，转化率高，而第二步由于涉及混菌混合发酵，一直是维生素C生产领域的难题。随着维生素C发酵行业竞争越来越激烈，发酵工艺的优化、资源的合理利用的要求不断提高。减少发酵过程环境的污染、提高原料的利用率，提高生产强度等等技术要求是今后生产发展的趋势。维生素C发酵第二步中糖酸转化率已经很高，一般都有90%以上，所以优化的重点就是缩短发酵周期，提高发酵生产强度。本专利就是基于这点，通过向发酵培养基中添加还原型谷胱甘肽提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸的生产强度。谷胱甘肽(glutathione)是一种自然界广泛存在、同时具有Y -谷氨酰基和巯基的活性三肽，在生物体内有多种重要的生理功能，特别是具有抵抗渗透压和维持体内正常的氧化还原环境的能力。目前，添加谷胱甘肽旨在促进混菌体系更好的适应发酵环境，提高菌体特别是酮古龙酸菌生物量，从而缩短发酵周期，提高发酵生产强度。
本发明的目的是添加还原型谷胱甘肽促进菌体生长，缩短发酵周期和产量，从而提高产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法。1.菌株酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM 4025 及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 21916，由江山制药有限公司(靖江)提供。2.培养基和培养方法种子培养基(g/L) =L-山梨糖20，玉米浆1. 5，牛肉膏3，酵母浸出物3，大豆蛋白胨 10，磷酸二氢钾1，无水硫酸镁0. 2，尿素1，碳酸钙1。发酵培养基(g/L) :L-山梨糖80，玉米浆5，尿素12，磷酸二氢钾1，无水硫酸镁30. 1，碳酸钙5，其中碳酸钙、L-山梨糖和氮源分别单独灭菌，接种时添加，还原型谷胱甘肽用超纯水配制，0. 22 μ m过滤除菌，接种时添加。培养基都由自来水配制，用氢氧化钠调节pH到6. 7-7. 0，灭菌121°C，15min。3.大菌和小菌混合培养方法用接种环挑取平板上的小菌两环，再挑取大菌一环制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30°C培养48h ；取斜面混合菌活化后菌液0. 4mL接种种子培养基75mL/750mL摇瓶中。 30°C，200rpm下培养18h，即制成大小菌混菌混合菌系，接入甘油管中进行保藏。4.培养方法从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物种液IOmL接入发酵培养基(75mL/750mL摇瓶)，30°C，200rpm培养，定期取样测定参数。5.分析方法菌体浓度测定取适量的菌悬液置于IOmL容量瓶中，加入适量的4mol/L盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，再加入去离子水定容至10mL，摇勻，用UV7500型可见光分光光度计，于 660nm处比色测OD值。2-KLG与L-山梨糖含量测定采用高效液相色谱(HPLC)测定。色谱柱=Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相0. 005mol/L H2S04,流速0. 5mL/min,柱温；35 °C，进样量 5 μ L，检测器示差折光检测器。本发明的有益效果在发酵培养基中添加lg/L的还原型谷胱甘肽，与对照组相比较，发酵周期缩短了 11.8% (60h)，2-KLG产量提高了 5.07% (66. 3g)，生产强度提高了 27. 6% (1. llg(L · h)-1)。图1，为添加lg/L GSH对混合菌系生长的影响，图例■未添加GSH ;〇添加Ig/ L 的 GSH。图2，为添加lg/L GSH对混合菌系发酵产2_酮基-L-古龙酸的影响，图例■未添加 GSH5O 添加 lg/L GSH。


本发明阐述了一种添加还原型谷胱甘肽(GSH)提升酮古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于维生素C发酵生产领域。本发明利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过向发酵培养基中添加1g/L的还原型谷胱甘肽，促进混菌体的生产，提高生物量，缩短发酵周期，提高生产强度，实现2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的高效生产。添加1g/L GSH条件下，发酵周期为60h，2-KLG产量为66.3g/L，生产强度为1.11(g(L·h)-1)，与对照组相比发酵周期缩短了11.8％，2-KLG产量和生产强度分别提高了5.07％和27.6％。