一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用的制作方法【技术领域】；具体地，本发明涉及一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用。[0002]谷胱甘肽(简称GSH)，又名Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是一种广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的一种小分子巯基化合物，具有维持胞内氧化还原平衡的功能。GSH重要的生理功能使其在医学、食品、化妆品等方面具有广泛的应用价值[MeisterA and Anderson M.E., Glutathione.Annu Rev Biochem, 1983.52:p.711-760; Wuj G.,.Fang Y.Z, Yang S., Lupton J.R., and Turner N.D.Glutathione Metabolism and ItsImplications for Health.J.Nutr.，2004.134:p.489-492.] 0[0003]目前GSH的生产方法主要为化学合成法和生物法。虽然化学合成法和从富含胞内GSH的酵母细胞中提取GSH已实现工业化，但是两者都存在一定的不足之处。化学合成法较早应用于GSH的生产，但具有复杂、耗时等不足[吴坚平，林建平，岑沛霖.谷胱甘肽的生物合成.1999.]。GSH在生物体内是由Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )在ATP存在的条件下，催化L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸进行序贯反应合成。生物法生产谷胱甘肽主要包括酶转化法和发酵法两种方式，两者均通过利用细胞中的高活性酶系在温和的条件下实现GSH的合成；其最主要的区别则在于酶转化法需提供ATP，而发酵法则可利用细胞自身代谢，无需额外提供ATP。目前发酵法生产GSH的产量不高，且分离纯化工艺复杂，原料成本和能耗等成本都比较高；相对于发酵法，酶法反应时间短，反应简 单，能够达到更高浓度和纯化收率等优点，是规模化生产GSH工艺研究的方向。[0004]酶法合成GSH，高活性的谷胱甘肽合成酶是获得高浓度产物的关键之一。在已报道的谷胱甘肽合成酶中，除了上述常见的GSH I和GSH II，还发现了具有高活性的谷胱甘肽双功能合成酶，例如来源于无乳链球菌的谷胱甘肽双功能合成酶，以及来自嗜热链球菌的谷胱甘肽双功能酶，嗜热链球菌的谷胱甘肽双功能酶12h即可产生10.4g/L GSH, L-半胱氨酸的转化率达到85%。这些酶的发现，为酶法合成GSH的规模化生产提供了可能。[0005]GSH的合成伴随着ATP的消耗(合成IM GSH需消耗2M ATP)，由于ATP价格昂贵，直接添加ATP显著增加了酶法合成GSH的成本，并且高浓度的ATP及其代谢产物ADP的存在还会强烈抑制GSH合成酶的活性，因此目前酶法生产GSH都采用ATP再生，主要采用酵母细胞再生的方式。目前酵母细胞再生ATP已发展到采用固定化酵母细胞再生的技术水平，从而实现再生系统的重复使用。这就为GSH合成酶的重复利用提出了相应的要求。[0006]固定化酶(immobilized enzyme)是一种将酶固定于载体上的技术。一般地,经过固定化的酶本身还是溶于水的，只是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶的流动性降低。目前固定后的酶虽然稳定性增加，易从反应系统中分离，便于运输和贮存，但是活性降低(一般仅为游离酶的30%以下，甚至于仅为10%以下)。[0007]目前也存在利用固定化细胞制备GSH的工艺，但是由于细胞本身需要能量的消耗，以及生长周期的限制，因此不能长时间的反复利用，酶活也较低。此外，在体外利用L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸进行序贯反应合成对酶的活性提出了很高的要求。由于上述原因，目前本领域还没有一种固定化谷胱甘肽合成酶，因此迫切需要突破酶法生产GSH的瓶颈，开发相应的固定化酶用于工业生产GSH。


[0008]本发明的目的就是提供一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用。 [0009]在本发明的第一方面，提供了一种固定化的谷胱甘肽合成酶，所述的固定化的谷胱甘肽合成酶包括:
[0010](I)固定化载体；和
[0011](2)固定于所述载体的谷胱甘肽合成酶。
[0012]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶通过选自下组的方式固定于固定化载体:吸附、包埋、共价结合、交联、或其组合。
[0013]在另一优选例中，所述的固定化载体与所述的谷胱甘肽合成酶的质量比例为:I: 1—100:1 (较佳地为 10:1 — 50:1)。
[0014]在另一优选例中，所述的固定化载体包括固定化载体的基质，以及与所述基质连接的连接元件。
[0015]在另一优选例中，所述的固定化载体的基质为微球或高分子聚合物。
[0016]在另一优选例中，所述固定化的谷胱甘肽合成酶的结构如下:
[0017]Z- (L-E) n
[0018]式中，
[0019]Z表不固定化载体基质；
[0020]E表示谷胱甘肽合成酶；
[0021 ] L表示位于E和Z之间的连接元件；
[0022]n为大于或等于I的正整数。
[0023]在另一优选例中，n为选自1-100000的正整数。
[0024]在另一优选例中，所述连接元件的主链具有4-50个选自C、N或0的原子。
[0025]在另一优选例中，所述连接元件的主链具有5-30个(优选4-20个，优选4_10个)选自C、N或0的原子。
[0026]在另一优选例中，所述连接元件的主链由或基本上由以下基团构成:-CH2-、-C(R)H-、-CO-、-NH-> -NR-> -0-,其中R表不支链基团，如0H、氛基、C1-C4烷基、卤素。
[0027]在另一优选例中，所述固定化的谷胱甘肽合成酶具有以下特性:
[0028](a)酶活性> 0.5U/g固定化的谷胱甘肽合成酶，优选> 2U/g固定化的谷胱甘肽合成酶；
[0029](b)半衰期特性≥10天，优选≥15天，更优选≥20天。
[0030]在另一优选例中，所述的固定化载体为有机载体。
[0031]在另一优选例中，所述的有机载体选自下组:酯基固定化载体、氨基固定化载体、羧基固定化载体、氰基固定化载体、或其组合。
[0032]在另一优选例中，所述的有机载体为氨基固定化载体或环氧基固定化载体。
[0033]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶通过以共价结合的方式固定于氨基固定化载体。
[0034]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶通过以共价结合的方式固定于环氧基固定化载体。
[0035]在另一优选例中，所述的氨基固定化载体选自下组:SEPABEADSUEC系列的EC-HA 或 EC-EA、Seplite LX-1000HA、或 Relizyme? 系列的 HA403 或 EA403 ;优选 EC-HA 和HA403。
[0036]在另一优选例中，所述的环氧基固定化载体选自下组:SEPABEADSWEC系列的EC-EP 或 EC-HFA、S印Iite LX-1000EP、或 Relizyme? 系列的 EP403 或 HFA403 ;优选 EC-HFA和 HFA403。
[0037]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶选自下组:Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )、GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )、或谷胱甘肽双功能合成酶、或其组合。
[0038]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶为Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )与 GSH 合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的组合。
[0039]在另一优选例中，Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )与GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II)的比例为 1:1~5:1。
[0040]在另一优选例中，所述的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II )来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0041]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶为谷胱甘肽双功能合成酶。
[0042]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽双功能合成酶为来源于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的谷胱甘妝双功能合成酶。
[0043]在另一优选例中，所述的谷胱甘肽合成酶为谷胱甘肽双功能合成酶与Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )的组合；或谷胱甘肽合成酶为谷胱甘肽双功能合成酶与GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的组合。在另一优选例中，谷胱甘肽双功能合成酶与Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )的比例为1:1~1:3。
[0044]在另一优选例中，谷胱甘肽双功能合成酶与GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的比例为1:1~4:1。
[0045]在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶的方法，包括步骤:将谷胱 甘肽合成酶固定于所述的固定化载体上，从而形成固定化的谷胱甘肽合成酶。
[0046]在另一优选例中，将谷胱甘肽合成酶固定于所述的载体上之前，还包括对载体进行活化的步骤。
[0047]在本发明的第三方面，提供了第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶的用途，它被用于生产谷胱甘肽GSH。
[0048]在本发明的第四方面，提供了一种生产谷胱甘肽GSH的方法，包括步骤:[0049](I)将第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶与反应底物接触，获得含有GSH的反应混合液；
[0050](2)从⑴中的反应混合液中分离GSH。
[0051]在另一优选例中，所述的反应底物包括甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸。
[0052]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0054]图1为固定化载体的结构示意图；A为长侧链载体EC_HFA、B为长侧链载体EC-HA，C为短侧链载体EC-EP。
[0055]图2为固定化酶EC-HA-SaGSH的稳定性曲线图。
[0056]图3为固定化酶EC-EP-STH的稳定性曲线图。
[0057]图4为谷胱甘肽双功能酶(Sa-GSH)与不同固定化载体固定化的比较。
[0058]图5为谷胱甘肽双功能酶(Sa-GSH)溶液酶的稳定性曲线图。

[0059]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将谷胱甘肽合成酶与载体进行固定化之后，得到稳定性大大提高的固定化谷胱甘肽合成酶；特别地，固定化载体与谷胱甘肽合成酶之间较长的连接元件可以获得特别好的固定化效果。本发明的固定化谷胱甘肽合成酶半衰期长，使得单位酶的生产力得到有效提高。用本发明的固定化谷胱甘肽合成酶作为GSH生物合成系统，生产过程简化、生产效率提高，简化了提纯工艺。
[0060]GSH
[0061]如本文所用，术语“GSH”、或“谷胱甘肽”、或“ Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸”，都可以互换使用。GSH是一种广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的一种小分子巯基化合物，具有维持胞内氧化还原平衡的功能。
[0062]GSH的主要生理功能是清除自由基、抗氧化、抗衰老等。机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生，GSH可消除自由基，能起到强有力的保护作用。GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH易被氧化脱氧，这一特异结构便使其成为体内主要的自由基清除剂。GSH不仅清除人体自由基，还可以提高人体免疫力，增进血球制造保护物质的功能，保护物质指能保护身体免受感染的物质，降低体内发炎物质的总含量。
[0063]谷胱甘肽合成酶
[0064]如本文所用，术语“谷胱甘肽合成酶”、“GSH合成酶”或“ Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶”都可以互换使用，都是指合成GSH的酶蛋白。
[0065]谷胱甘肽合成酶主要包括单功能酶和双功能酶。在生物体内，GSH是由Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2, GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II )在ATP存在的条件下，催化L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸进行序贯反应合成的。
[0066]除了 GSH I和GSH II，高活性的谷胱甘肽双功能合成酶，包括(但不限于):来源于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的谷胱甘肽双功能合成酶，以及来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的谷胱甘肽双功能酶等。
[0067]在一个优选例中，生产谷胱甘肽双功能合成酶的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)包括(但不限于):粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、瘤胃甲烧短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
[0068]在一个优选例中，生产谷胱甘肽双功能合成酶的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)包括(但不限于):幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、瘤胃甲烧短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
[0069]本领域的普通技术人员可以使用常规方法制备谷胱甘肽合成酶，如市售购买、从菌株中分离、全化学合成、或者通过分子生物学体外合成。
[0070]从菌株(优选无乳链球菌和嗜热链球菌)中分离谷胱甘肽合成酶以及所述菌株的培养是本领域的普通技术人员所熟知的，除了生产菌不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产以及提纯蛋白的方法基本相同。本发明菌株的发酵条件与一般的菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培 养基中，在PH5.0-9.0 (较佳地pH7.0-7.5)和20-45°C (较佳地25-400C )发酵。在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并在4°C环境下进行初步保藏。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。
[0071]通过分子生物学体外合成和分离谷胱甘肽合成酶是本领域的普通技术人员所熟知的。本发明以对不同来源的谷胱甘肽合成酶基因进行基因工程菌构建，利用不同的固定化载体进行固定化，或对双酶进行共固定。
[0072]根据谷胱甘肽合成酶基因序列，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过PCR方法来构建本发明的编码核酸序列。
[0073]包含编码谷胱甘肽合成酶基因序列可以表达调控序列可操作性相连。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0074]本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体，用于表达谷胱甘肽合成酶。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将谷胱甘肽合成酶基因序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。
[0075]将所述编码谷胱甘肽合成酶基因序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于:磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev BiolStand 1996;86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残洛,收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
[0076]可将上述制备获得的酶蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
[0077]固定化载体
[0078]本发明涉及一种特别适合用于固定谷胱甘肽合成酶的固定化载体，所述的固定化载体包括固定化载体的基质，以及与所述基质连接的连接元件。
[0079]用于固定谷胱甘肽合成酶的载体优选有机载体。所述的有机载体选自下组:酯基固定化载体、氨基固定化载体、羧基固定化载体、氰基固定化载体。
`[0080]优选地，所述连接元件的主链具有4-50个选自C、N或0的原子。
[0081]在另一优选例中，所述连接元件的主链具有5-30个选自C、N或0的原子。
[0082]在另一优选例中，所述连接元件的主链由或基本上由以下基团构成:-CH2-、-C(R)H-、-CO-、-NH-> -NR-> -0-,其中R表不支链基团，如0H、氛基、C1-C4烷基、卤素。
[0083]在本发明中，所述的酯基固定化载体是指与谷胱甘肽合成酶固定的活性基团为酯基。
[0084]在本发明中，所述的氨基固定化载体是指与谷胱甘肽合成酶固定的活性基团为氨基。
[0085]在本发明中，所述的氰基固定化载体是指与谷胱甘肽合成酶固定的活性基团为氰基。
[0086]在本发明中，所述的羧基固定化载体是指与谷胱甘肽合成酶固定的活性基团为羧基。
[0087]有机载体优选氨基固定化载体或环氧基固定化载体。所述的氨基固定化载体选自下组:SEPABEADSR EC 系列的 EC-HA 或 EC-EA、Seplite LX-1000HA、或 Relizyme? 系列的HA403或EA403。所述的环氧基固定化载体选自下组:SEPABEADSR EC系列的EC-EP或 EC-HFA、Seplite LX-1000EP、或 Relizyme? 系列的 EP403 或 HFA403。[0088]本发明特别优选SEP ABEADS?EC系列的载体。此类载体的基质为高度多孔聚甲基丙烯酸球状，具有稳定的物理和化学性质，并且在高浓度溶液和通常溶剂中的膨胀率低，具有优异的机械渗透稳定性。SEPABEADS?EC系列的几种载体的结构见表1。
[0089]表1