一种猪乙型脑炎病毒纯化方法[0002]流行性乙型脑炎是由黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的一种人兽共患的疾病。猪被认为是本病最重要的自然增殖动物，能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎；临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。猪乙型脑炎流行不仅给养猪业造成严重危害，而且还严重威胁人类健康。[0003]疫苗是预防该病的主要方法之一。目前，我国商品化的猪乙型脑炎疫苗主要是鼠脑灭活疫苗和弱毒疫苗。其中以弱毒疫苗为主，其安全性和有效性主要受病毒滴度和抗原纯净性等因素的影响。商品化疫苗如果直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，会受到细胞破碎产物，培养基成分，细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量基本途径。[0004]中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术(Tangential Flow Filtration, TFF)的范畴，又称错流过滤(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。[0005]和传统的平板膜包相比，中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。[0006]目前，对于猪乙型脑炎病毒的中空纤维澄清纯化及浓缩工艺尚无报道。
[0007]本发明旨在解决现有猪乙型脑炎病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技术问题，提供一种使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现的猪乙型脑炎病毒纯化方法。[0008]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一种猪乙型脑炎病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，过程如下:
[0010]I系统的组装
[0011]无菌条件下，将微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统按照组装要求进行组装。在微滤澄清纯化系统中可安装无菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整无损的中空纤维微滤膜,在超滤浓缩纯化系统中可安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。
[0012]2系统完整性检测
[0013] 压力保持法检测系统的完整性。[0014]3系统的处理
[0015]3.1清洗及灭菌
[0016]将0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0017]3.2水洗及通量检测
[0018]灭囷结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料--!，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0019]3.3PBS 处理
[0020]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。
[0021]上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。[0022]一种猪乙型脑炎病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，该方法包括以下步骤:[0023]I)将无菌吐温20按0.5%~10%(v/v)的比例加入猪乙型脑炎病毒液中，振荡处理；
[0024]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；
[0025]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用；
[0026]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；
[0027]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用；
[0028]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0029]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD或300KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0030]8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0031]9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0032]10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
[0033]将上述制备的病毒浓缩液成品保存于_20°C。
[0034]上述猪乙型脑炎病毒纯化方法，采用的是二步纯化法，第一步通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤病毒液，除去毒液中的细胞碎片；第二步通过较小孔径的澄清纯化滤膜洗滤第一步的滤过液，达到除去病毒液中的吐温20、小分子蛋白，细胞代谢产物的小分子物质等杂质及实现浓缩病毒等目的。[0035]上述猪乙型脑炎病毒纯化方法，步骤I)所述的振荡处理时间优选为IOmin ;步骤I)所述的比例优选为5% ;步骤2)所述的微滤的滤膜孔径优选为0.65 μ m ;步骤7)所述的超滤滤膜孔径优选为300KD ;步骤2、3、4、5、7、8、9、10中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均优选为400rpm循环30min ;利用该方法制备的病毒浓缩液成品用于制备疫苗；上述所述病毒澄清纯化及浓缩方法，步骤2)中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90% ;步骤7)中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩10倍以上。
[0036]上述技术方案中，步骤I)所述的猪乙型脑炎病毒液是指制备得到的病毒原液，未经稀释处理；步骤I)加入吐温20起到乳化作用，能够有效避免病毒粒子聚集成团，从而提升后续过滤效率。
[0037]所述微滤澄清纯化系统是指GE公司制造的FlexStand中空纤维澄清纯化系统；所述微滤膜可以选自GE公司制造的、型号为CFP-6-D-9A，CFP-4-E-9A的Xample微滤柱膜；所述超滤膜可以选自GE公司制造的、型号为UFP-300-C-9A，UFP-100-C-9A的Xample超滤柱膜。
[0038]上述制备的病毒浓缩液成品的检测方法如下:
[0039]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。其中病毒滴度的检测方法为:
[0040]以观察细胞病变测定TCID5tl的方法对各样品的病毒滴度进行检测，纯化有效的判定标准为:浓缩纯化及重复洗滤的洗滤液检测不出存活病毒；浓缩液的病毒回收率在80%以上。
[0041]蛋白含量的测定方法为:
[0042]以蛋白浓度测定试剂盒对浓缩病毒液的蛋白残存量进行测定，可溶性蛋白的残存量应低于原液可溶性蛋白的10%,表明工艺有效。
[0043]以上对本发明的
进行了详细说明。本发明的纯化方法综合采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了 JEV的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪乙型脑炎病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的猪乙型脑炎病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的猪乙型脑炎病毒疫苗，具有纯净度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等优点，同时,本发明工艺简便、成本较低，具有突出的规模化应用前景。

[0044]实施例中所用仪器型号如下:
[0045]FlexStand中空纤维澄清纯化系统；
[0046]Xample 微滤柱:CFP-6-D_9A (0.65 μ m)，CFP-4-E-9A (0.45 μ m)；
[0047]Xample 超滤柱:UFP-300-C_9A (300KD)，UFP-100-C-9A (100KD)；
[0048]上述仪器均购自GE公司。
[0049] 实施例中所用试剂如下:
[0050]100L猪乙型脑炎病毒液，108-5TCID50/ml,由本公司生产；
[0051]BCA蛋白定量试剂盒，购自康为世纪。[0052]JEV抗体诊断试剂盒，北京生物制品研究所生产。
[0053]0.5M NaOHlOOL ；
[0054]无菌0.1M PBS100L ；
[0055]无菌高纯水100L ；
[0056]吐温20，分析纯；
[0057]蔗糖明胶保护剂。
[0058]实施例1
[0059]I操作流程
[0060]1.1前处理
[0061]1.1.1系统的组装
[0062]无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.65 μ m、完整 无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜。
[0063]1.1.2系统完整性检测
[0064]压力保持法检测纯化系统的完整性。
[0065]1.1.3系统的处理
[0066]清洗及灭菌:
[0067]将0.5M NaOH溶液注满纯化系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0068]水洗及通量检测:
[0069]灭囷结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料--!，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0070]PBS 处理:
[0071]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。
[0072]1.2病毒的澄清纯化
[0073]1.2.1病毒液的处理
[0074]将5L无菌的吐温20加入100L猪乙型脑炎病毒(JEV)病毒液中，振荡处理lOmin。
[0075]1.2.2病毒液的澄清
[0076]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的病毒液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min,经0.65 μ m中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0077]1.2.3截留液的洗滤
[0078]第一次洗滤:
[0079]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液I。
[0080]第二次洗滤:
[0081]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液2。[0082]第三次洗滤:
[0083]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液3。
[0084]1.2.4病毒液的收集
[0085]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0086]1.2.5初级浓缩
[0087]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，400rpm循环30min,经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理,弃去透过液,进料罐中剩余截留液10L,记为初级浓缩病毒液。
[0088]1.2.6浓缩液的洗滤
[0089]第一次洗滤:
[0090]将10L0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去透过液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为二级浓缩病毒液。
[0091]第二次洗滤:
[0092]将10L0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为三级浓缩病毒液。
[0093]第三次洗滤:
[0094]将10L0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，即为病毒浓缩液成品。
[0095]2.2.7病毒液的收集
[0096]将经过上述处理后的得到的病毒浓缩液成品进行收集，保存于-20°C。
[0097]2有效性检测
[0098]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。
[0099]2.1病毒滴度的检测
[0100]以观察细胞病变测定TCID5tl的方法对各样品的病毒滴度进行检测，具体步骤如下:
[0101]2.1.1细胞的铺板及培养
[0102] 以0.05%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用幼仓鼠肾传代细胞(BHK-21)进行消化，以细胞生长液重悬为I X IO5Ail并接种于96孔细胞培养板，100 μ I/孔，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养24h。
[0103]2.1.2病毒的梯度稀释
[0104]将各收集的毒液样品取样，以0.1M PBS进行10倍倍比稀释10个梯度(10—1~10_10)。
[0105]2.1.3病毒的接种及培养
[0106]将稀释后各梯度病毒液接种于步骤(1)所述的检测用细胞，100 μ I/孔，每个梯度6个重复，同时设置不接病毒液的细胞对照，37°C，5%C02细胞培养箱中维持培养5~7天。
[0107]2.1.4统计并计算病毒滴度
[0108]统计出现细胞病变的孔数，以Reed-Muench法对猪乙型脑炎病毒的滴度(TCID5tl)进行计算，结果证实，浓缩后的病毒液的滴度明显高于浓缩前的病毒液，浓缩阶段的洗滤液及细胞对照组均无细胞病变，浓缩后病毒滴度达到109_°TCID5(l/ml，浓缩阶段的洗滤液无效价，病毒回收率接近100%。
[0109]2.2可溶性蛋白的检测
[0110]取各样品以BCA蛋白浓度试剂盒进行测定，经计算可溶性蛋白残存率为9.5%。
[0111]3疫苗制备
[0112]以上述工艺制备的病毒浓缩液作为原料，进一步制备疫苗，其工艺步骤如下:
[0113]3.1稀释配苗
[0114]将纯化浓缩后的JEV毒液以无菌的0.1M PBS进行稀释，使其病毒滴度达到108_5TCID5ciAil，将纯化前的 JEV病毒液(IO8 5TCID5cZml)与纯化后的 JEV病毒液(IO8-5TCID50/ml)分别加入适宜的蔗糖明胶保护剂，进行配苗；将纯化前的JEV病毒液和纯化后的JEV病毒液制备的疫苗分别记为JEV灭活疫苗I和JEV灭活疫苗2。
[0115]3.2 冻干
[0116]将两份配苗液，分别混合均匀，并分装至西林瓶中，每瓶分装2.3ml。使用相同的冻干程序(制品于_30°C以下预冻3h ;程序控温:_18°C 30min ；-8°C 30min ；-8°C 15h ；0°C 30min ；0°C 5h ；10°C 2h ；25°C 30min ；25°C 4h)进行疫苗的冻干。
[0117]4疫苗安全检验
[0118]以上述工艺制备的JEV活疫苗I (纯化前)，JEV活疫苗2 (纯化后)，无菌0.1M PBS溶液作为实验材料；以4~8日龄健康易感乳猪(JEV HI抗体阴性)12头和10~12g SPF小鼠30只作为实验动物。具体操作步骤如下:
[0119]4.1动物分组
[0120]将12头仔猪随机分为3组，每组4头。
[0121]4.2疫苗免疫
[0122]4.2.1乳猪安全性检验分别肌肉注射两种疫苗2ml (含10头份)于实验用乳猪，对照组注射2ml PBS,每组各注射4头。观察21日。
[0123]4.2.1小鼠安全性检验分别皮下注射两种疫苗0.1ml(含0.5头份)于实验用小鼠，对照组注射0.1ml PBS,同时右侧脑内空刺，每组各4头，观察14日。
[0124]4.3实验结果
[0125]免疫后21日，各组乳猪均无因接种疫苗而出现的局部或全身不良反应；免疫后14日，各组小鼠均全部健活。
[0126]5疫苗效力检验
[0127]5.1冻干后疫苗病毒滴度的检测
[0128] 将冻干后的JEV活疫苗I和JEV活疫苗2分别用Iml PBS溶解并进行病毒滴度的检测，方法同“3.1”。结果冻干后JEV活疫苗I的滴度为107_67TCID5cZml，JEV活疫苗2为108 0TCID50/mL.即冻干后JEV活疫苗2 (纯化后)的冻干损失率小于JEV活疫苗I (纯化前)。
[0129]5.2后备母猪免疫试验
[0130]以JEV活疫苗1，JEV活疫苗2，无菌0.1M PBS溶液作为实验试剂，利用JEV抗体诊断试剂盒测定JEV HI抗体；取将70~80kg健康易感后备母猪(JEVHI抗体阴性)12头作为实验动物。具体实验步骤如下:
[0131]5.2.1试验动物分组
[0132]将12头母猪随机分为3组，每组4头。
[0133]5.2.2疫苗免疫
[0134]分别颈部肌肉注射两种疫苗及PBS2ml于试验用后备母猪，每组各注射4头。
[0135]5.2.3采血及抗体检测
[0136]免疫之前及免疫后每周采血一次，共6次，分离血清，使用JEV抗体诊断试剂盒进行检测。
[0137]5.2.4实验结果
[0138]实验结果表明，由JEV活疫苗2 (纯化后)免疫的第二组母猪的抗体水平产生较早并高于JEV活疫苗I (纯化前)。
[0139]综上所述，利用本发明纯化得到的猪乙型脑炎病毒浓缩纯化液成品适用于制备猪乙型脑炎病毒疫苗，其安全性良好、免疫效力显著。
[0140]实施例2
[0141]I)将无菌吐温20按10%(v/v)的比例加入猪乙型脑炎病毒(JEV)病毒液中，振荡处理IOmin ；
[0142]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；
[0143]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液；
[0144]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；
[0145]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用。
[0146]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0147]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0148]8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0149]9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0150]10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
[0151]实施例3
[0152]I)将无菌吐温20按0.5%(v/v)的比例加入猪乙型脑炎病毒(JEV)病毒液中，振荡处理IOmin ；
[0153] 2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵以400rpm的条件循环30min,而后经0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤,收集透过液待用；[0154]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min，收集透过液，得到第一洗滤液待用；
[0155]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min，收集透过液，得到第二洗滤液待用存；
[0156]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min，收集透过液，得到第三洗滤液待用。
[0157]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0158]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩系统的进料罐，开启循环泵以400rpm的条件循环30min,经300KD中空纤维超滤柱进行超滤处理,弃去透过液,收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0159]8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min,弃去透过液,收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩
病毒液；
[0160]9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min,弃去洗滤液,收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩
病毒液；
[0161]10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以400rpm的条件循环30min，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
[0162] 以上对本发明实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。