专利名称：一种体外构建的气管替代品及其制备方法一种体外构建的气管替代品及其制备方法技术领域本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种体外构建的气管替代品及其制备方法。组织工程学是应用生命科学和工程学的原理和方法，研究、开发用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代品的一门新兴科学。它的核心内容是体外三维细胞培养，基本方法是将细胞经体外扩增后与可降解生物材料相结合形成细胞——可降解生物材料复合体，用以替代受损组织器官。它具有形成具有生命力的活体组织，少量细胞修复大块缺损，并可按组织、器官缺损情况任意塑型等特点。目前有报道，体外构建组织工程化软骨、皮肤已获得成功，但组织工程化气管替代品尤其是带有完整上皮组织的气管替代品尚未见报道。发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种体外构建的气管替代品及其制备方法。本发明在体外构建有上皮层和真皮层的上皮组织，所述的真皮层中包含由血管内皮细胞及成纤维细胞)。并将之贴附于气管替代品内面，制备组织工程化气管。本发明还可在组织工程化气管外层包裹大网膜，制备成类似“三明治”结构的气管替代品。完整的上皮组织是理想的气管替代品所必须的，它可以阻止肉芽组织长入，防止管腔阻塞。而充足的血供是上皮组织存活的前提，正常气管粘膜下层有丰富的毛细血管网。 正常组织再血管化主要有血管生成、血管发生两种形式。血管生成即局部血管再生是指正常组织血管内皮细胞通过降解血管基底膜，出芽生长进入再生组织基质，经过增生形成毛细血管。血管发生则由骨髓中血管内皮细胞在某些细胞因子刺激下游离至再生组织生成毛细血管。本发明同时利用上述两种再血管化方法，短时间内与受体血供再通，从而为组织工程化气管上皮提供血供。本发明是通过下述技术方案实现的。先取患者皮肤标本，分离培养表皮细胞和成纤维细胞。血管内皮细胞可由患者骨髓、脂肪组织以及取动静脉血管获得。上述种子细胞体外培养扩增至所需细胞量后，先将成纤维细胞和血管内皮细胞混合接种于各类组织工程化皮肤支架材料上，构建成纤维细胞、血管内皮细胞——支架材料复合物。体外培养7-10 天后再于其表面接种表皮细胞，构建组织工程化上皮组织。然后将所的组织工程化上皮组织贴附于各类人工气管代用品内侧面，构建组织工程化气管替代患者气管。本发明组织工程化气管具有如下结构特点1.组织工程化气管内层具有组织工程化上皮组织；2.组织工程化上皮组织，表皮层种植有上皮细胞(纤毛上皮细胞或鳞状上皮细胞)，真皮层种植有成纤维细胞、血管内皮细胞；3.组织工程化上皮组织真皮层中可加入VEGF、ECGF、BFGF等促血管生成因子，促进豁膜下层毛细血管网的形成，为上皮组织提供血供，防止上皮坏死肉芽组织增生；4.外层是各类气管替代品，如组织工程管状软骨、人工合成材料气管替代品等；5.组织工程化上皮组织中的支架材料包括脱细胞基质等生物材料，和聚轻基乙酸( PGA )等各类人工合成材料。实施例
组织工程化上皮组织的构建 1)分离与培养表皮角朊细胞取患者表皮修剪成宽l_2mm的条状，无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.5 % 中性蛋白酶(Dispase II)中4 0C过夜。将表皮从真皮上撕下后，剪碎，用0.05 %胰酶-0. 53mM EDTA在37 V消化20分钟，IOml胰酶抑制剂终止消化。经150目不锈钢滤网过滤、离心、计数后制成单细胞悬液，按3X 106/75cm2密度接种培养，无血清表皮细胞培养基(GIBRO，USA)，另加牛垂体提取物和重组表皮细胞生长因子，在37 °C，5 % CO2,饱和湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。当细胞达到60-75 %密度融合时，经 0. 05 %胰酶37 0C消化10分钟，按1 3的比例传代培养。
2 )真皮成纤维细胞分离与培养分离消化将上述真皮碎块，在0.2 %的胶原酶37 V消化2小时，经150目不锈钢滤网过滤，以1200r / min离心5分钟，弃去上清，加入无钙镁PBS清洗3次。加入含10 % 胎牛血清的DMEM培养液IOml，混勻，台盼蓝染色计数。
原代培养计数后制成单细胞悬液，按1-2 X 106/75cm2密度接种培养，含10 % 胎牛血清的DMEM培养液，在37 °C，5 % CO2，100 %相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。当细胞融合到60 % -75 %密度时，用IOml无钙镁PBS冲洗，经0.25 %胰酶37 V消化5分钟，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1200r / min离心5分钟。弃去上清液，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液 IOml，混勻，计数，按1 3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60 % "75 %密度时，再传代培养。
3 )血管内皮细胞提取(下述方法可单独或联合应用)骨髓来源血管内皮细胞提取方法抽取骨髓5-10ml，PBS清洗，离心速度1 500g XlOmin。Ficoll 分离(5ml 细胞悬液+ Ficoll 5ml，离心速度 200g X25min )，提取有核细胞，PBS + EDTA清洗两次。加入标有磁珠的⑶31抗体6_12 V放置15min ； 每108细胞+ 5-10ccPBS清洗两次。
MACS分离MS + / RS +柱，预先500ulPBS浸润，细胞悬液过柱后PBS500ul 清洗滤柱3次。ImlPBS冲洗滤柱得⑶31 +细胞。
静脉血管、动脉血管来源血管内皮细胞提取方法取静脉血管、动脉血管5-10CM，两端结扎，管腔内灌注经0.25-0. 5 %胰酶或0.5 % 中性蛋白酶(Dispase II )，37°C, 5 % CO2，饱和湿度的培养箱中放置5-10分钟，放开4一端，倒出内容物，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1200r / min离心5分钟。PBS清洗两次。
脂肪组织来源血管内皮细胞提取方法将抽取的脂肪组织移入离心管中，1200r / min离心5分钟。弃去上清液，加入含 10 %胎牛血清的DMEM培养液IOml，混勻。分离脂肪组织中毛细血管。0.25-0.5 % 胰酶或0.5 %中性蛋白酶(Dispase II)，37 0C , 5 % CO2，饱和湿度的培养箱中放置 5-10分钟。加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1200r / min 离心5分钟。PBS清洗两次。
4 )构建组织工程化上皮组织收集体外培养的血管内皮细胞和真皮成纤维细胞，将其接种于组织工程化皮肤支架材料上，接种密度IXlO5 -IO8。培养液3天换一次，培养7-10天后，按上述方法收集表皮细胞，将其接种在血管内皮细胞、成纤维细胞一可降解支架材料复合物表面。一周后将复合物表面暴露，形成气一液界面，促进上皮细胞的进一步角化。
构建组织工程化气管将按上述方法构建的组织工程化皮肤卷曲成桶状，放置于各种人造气管替代品或组织工程化管状软骨内侧，并在管腔内置金属支架，使两者紧密结合，构建成类似“三明治”组织工程化气管。


本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种体外构建的气管替代品及其制备方法。本发明体外构建组织工程化上皮组织，并将之种植于气管替代品内侧面，制成组织工程化气管。本发明利用各种来源血管内皮细胞重建组织工程化上皮组织真皮层毛细血管网，同时利用两种再血管化方法，短时间内与受体血供再通，从而为组织工程化气管上皮提供血供。本发明解决气管替代品上皮化这一难题。