专利名称：用于癌症治疗的致敏树突状细胞的癌胚胎抗原/未成熟层粘连蛋白受体肽的制作方法癌胚胎抗原/未成熟层粘连蛋白受体蛋白(OFA/iLRP)的初始鉴定由三个研究癌胚胎抗原或层粘连蛋白受体的独立的组完成[1-3]。OFA/iLRP是高度保守的蛋白质，其在一系列不同癌症中过表达并具有作为核糖体蛋白P40的双重功能W-27]。OFA/iLRP蛋白包含295个氨基酸的单多肽链并具有约37-44KDa的分子量。OFA/iLRP的结构最近已被阐明至2.15A并显示出OFA/iLRP的第112到140位氨基酸之间的区域涉及OFA/iLRP的二聚化，所述二聚化用于形成层粘连蛋白受体蛋白(LRP)[观]。层粘连蛋白受体的成熟形式似乎为乙酰化的未成熟LRP的二聚体，其具有67kDa的分子量。尽管成熟的67kDa形式出现在许多正常细胞和肿瘤细胞中，似乎胚胎细胞和肿瘤细胞偏好表达OFA/iLRP。因此，该表达模式使OFA/iLRP成为致敏免疫系统的可能的候选蛋白质，其用于治疗癌症和其他疾病[6]。 因此，特定OFA/iLRP肽在基于树突状细胞的治疗中的用途是新的应用。树突状细胞(DC)是免疫细胞，其形成哺乳动物免疫系统的一部分。它们的主要功能为加工抗原物质并将其呈递于免疫系统其它细胞的表面。因此，它们起抗原呈递细胞的功能。树突状细胞直接与非淋巴组织通信并调查非淋巴组织的损伤信号(如缺血、感染或炎症)或肿瘤生长。一旦收到信号，树突状细胞就通过释放IL-1、TNF α以及多种触发淋巴细胞和骨髓细胞的其它炎症细胞因子来启动免疫应答。多种(如对肿瘤的)免疫缺陷被认为是由于树突状细胞功能缺失造成的。树突状细胞具有高的致敏MHC限制性T细胞的能力并提供了在原位呈递抗原给T细胞的有效途径，其既包括T细胞发育期间的自身抗原也包括免疫期间的外来抗原。因此，在将离体树突状细胞用作肿瘤或传染病疫苗佐剂方面存在日益增长的兴趣。树突状细胞可以源自一系列不同的来源(骨髓和淋巴)，其可指导免疫系统攻击特定抗原。例如，其可源自以下来源单核细胞来源(CD 14+)、造血干细胞来源 (CD34+ 或 CD133+ 或 CDl 17+)、类浆细胞(CD303+/CD304+)、骨髓来源(CDlc+ 或 CD141+ 或 CD209+)或朗格汉斯细胞。一旦已致敏，无论离体、体内或体外，树突状细胞将帮助个体自身免疫系统防止或治疗所有类型的OFA/iLRP相关疾病或癌症。树突状细胞的致敏或脉冲处理(pulse)是使树突状细胞暴露于靶蛋白质来引起靶向免疫应答的方法。已显示OFA/iLRP树突状细胞治疗提高晚期癌症患者存活，副作用最小[13，22]。 以前的实验使用具有假定的MHC (主要组织相容性复合物)结合序列的肽致敏树突状细胞。 然而，假定的MHC结合位点由于其在肽上的位置或由于其跨多个肽，可能被免疫系统漏掉。 Siegel等人使用靶向于HLA-AM01的肽，但没有考虑到肽溶解度和其它与肽相关的问题4[22]。Rohrer等人分析了与小鼠来源的OFA/iLRP 12肽重叠的氨基酸的增殖谱[29]。该研究重点在分析Χ/η比，其中X为蛋白质氨基酸长度而η为肽长度(图1)。然而，基于该连续(sequential)肽方法，假定的HLA (人白细胞抗原)位点由于多种原因仍可能被免疫系统漏掉或无法识别，所述原因包括但不限于肽可溶性、肽结构、HLA位点位于两肽之间、 HLA位点侧面与限制HLA结合的氨基酸相接以及不适当的二级结构。因此，尽管能提供信息，连续肽的使用具有高的可能性漏掉本可被识别(如果处理了全长蛋白质)的有用蛋白质序列。事实上，之前的工作没能显示通过组合公开可用的HLA结合序列预测程序和使用寻找更可能产生免疫应答的区域的统计学方法已经找到的若干假定HLA结合位点。此外，先前的基于OFA/iLRP细胞的治疗使用了细菌表达的或小HLA特异性肽[13， 22]。细菌表达费时并难于以GMP认证的方式生产。因此，存在开发专门设计的肽的需要，所述肽带有具有增加数目的假定MHC结合位点的区域，其用于刺激树突状细胞和免疫系统。 还存在开发使用肽的有效的OFA/iLRP树突状细胞治疗的需要。发明概述本发明一方面提供了能够致敏树突状细胞的分离的肽或其混合物。所述肽的实例包括但不限于VLQMKEEDV、QMKEEDVLK、QMEQYIYKR, GIYIINLKE、KLLLAARAI,、LLLAARAIVA、 LLAARAIVA, LAARAIVAI, AAATGATPI、TPGTFTNQI、RLLWTDPR、DPRADHQPL、QPLTEASYV、 PLTEASYVNL、MLAREVLRM、LRMRGTI SR. EIEKEEQAA、EKEEQAAAEK、KEEQAAAEK、EEQAAAEKA、 QAAAEKAVTK、AAAEKAVTK、VPSVPIQQF 和其混合物。可将额外的氨基酸添加至所述肽或肽混合物的N-端和/或C-端。在一个实施方案中，本发明的肽包括以下肽:PRADHQPLTEASYVNLPT(129), FREPRLLffTDPRADHQPLTEA(117)、 GRFTPGTFTNQIQAAFREPT(lOl)、 EEIEKEEQAAAEKAVTKEEFQG(208)、 TDPRADHQPLTEASYVNLPT(129-a)或 TTOKLLLAARAIVAIENPADV(54)。在另一个实施方案中，本发明的肽源自OFA/iLRP的二聚化区域。所述肽能够致敏树突状细胞。本发明的肽可以与提高所述肽的免疫刺激作用、稳定性和/或可溶性的载体缀合。所述载体的实例包括但不限于，匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、生物学聚合物、抗体、化疗、碳纳米管、微电子/电流体装置、分子机器、氨基酸MAP聚合物、生物学活性脂质、 生物学活性糖分子/聚合物和胶体颗粒。本发明的肽也可被修饰以包括乙酰化、脂肪酸化、肉豆蔻酸化、棕榈酰化、苄氧羰基化、酰胺化(abidation)、对硝基苯胺、AMC、琥珀酰化、NHS、CMK/FMK、D_氨基酸、二硝基苯甲酰化、甲基化、磷酸化、六狀、503!12、辛酸、生物素411^、6六11、丹磺酰化、1 ^、附肌(、01卩八、 成环(cyclic formation)或多抗原肽系统(MAP)。本发明另一方面提供了包括本发明肽的组合物。该组合物可以是药物组合物或疫苗。所述药物组合物可以包含药物学可接受的载体。该组合物也可以是由本发明的肽致敏的树突状细胞。本发明还提供了治疗患有OFA/iLRP相关癌症的对象的方法。该方法包括给对象以足够减少OFA/iLRP相关癌症发展的量施用本发明的肽(单独地或作为混合物)的步骤。 在一个实施方案中，所述肽在对象中诱导减少OFA/iLRP相关癌症发展的免疫应答。在另一个实施方案中，治疗患有OFA/iLRP相关癌症的对象的方法包括步骤(a)用本发明的肽致敏树突状细胞，(b)以足够诱导免疫应答的量给对象施用已致敏的树突状细胞，所述免疫应答减少OFA/iLRP相关癌症的发展。本发明的肽还可用于测定样品中OFA/iLRP抗体的量的方法。该方法包括(a)在使得抗体与肽结合形成复合物的条件下使本发明的肽与样品接触，(b)测定样品中形成的复合物的量。在另一个实施方案中，本发明的肽用于监测对象中OFA/iLRP相关癌症的疫苗接种治疗的进展的方法。该方法包括步骤(1)向对象的部位皮下或皮内施用本发明的肽，施用的量足以检测对象对治疗的免疫应答，(2)监测在所述施用部位的反应直径。在另外的实施方案中，本发明的肽用于离体检测对象中OFA/iLRP相关癌症治疗的进展的方法。所述治疗可诱导T细胞相关应答或B细胞相关应答。该方法包括步骤(1) 提供接受治疗的对象的生物流体，(2)在使得肽与T细胞、B细胞或T细胞或B细胞产生的产物相互作用的条件下，使本发明的肽与所述生物流体接触，( 通过ELISA、荧光偏振、共振或FACS方法测定相互作用的量。通过参考以下描述并结合附图，本发明上述的和其它特征以及获取和使用它们的方式将更显而易见，并将被最好地理解。附图仅描述了本发明的一般的实施方案并不因此限制其范围。附图简述图1. OFA/iLRP和HLA结合基序的计算机分析。㈧氨基酸数目作为预测的函数的图。(B)氨基酸数目作为％ OPT的函数的图。(C)分布位点数目作为5氨基酸分组(bin) 的函数的图。图2.所选择的用于树突状细胞致敏的肽的Whisker图。聚类的HLA结合肽作为％ OPT函数的图。实心圆显示了可歪曲结果并造成发现最强免疫原性区域的错误表示的离群值。图3.脉冲处理的树突状细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析。(A)用全长重组人OFA脉冲处理的树突状细胞的FACS。(B)用肽混合物脉冲处理的树突状细胞的FACS。(C) 脉冲处理剂对树突状细胞识别1 肽的影响的图。图4.肽修饰对树突状细胞识别129区域的影响。㈧129肽的FACS。(B) 129a肽的FACS。(C) 1 和129a区域的平均荧光强度(MFI)。(D)脉冲处理剂对树突状细胞识别 129肽(相比于129a肽)的影响的图。图5. OFA/iLRP肽对细胞粘附的影响。(A)DU_145细胞粘附的图。(B) SK-MEL细胞粘附的图。图6. OFA/iLRP肽对细胞活力的影响。㈧肽1的细胞活力图，有或无层粘连蛋白。 (B)肽2的细胞活力图，有或无层粘连蛋白。(C)肽3的细胞活力图，有或无层粘连蛋白。发明详述本发明一方面提供肽或肽混合物，其可用于针对OFA/iLRP脉冲处理树突状细胞。 所述肽(其指导免疫系统识别OFA/iLRP蛋白的特定区域)围绕一系列独特的蛋白质区域进行设计，例如同型二聚体形成区域、层粘连蛋白结合区域、多药耐药区域、核糖体相互作用区域和其它具生物学意义的位点。所述肽基于全长蛋白质进行设计，重点在于对OFA/ iLRP 二聚体形成、抗原性、MHC-I结合、MHC-2结合、蛋白酶体裂解、溶剂可接近性和蛋白序列具有特异性的肽。本发明使用计算机和统计学分析确定可用于OFA/iLRP相关疾病治疗的最优的肽。本方法使得可以进行X-n肽的计算分析以及加上多重肽长度的快速分析，增加了使用OFA/iLRP或任何其它用于相似治疗/疗法的可能的蛋白质来开发用于树突状细胞或疫苗接种治疗的最优的肽的可能性。为测定不同OFA/iLRP 表位的分布，使用 SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic SYFPEITHI database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics(1999)50 213-219 (access via :www. syfpeithi. de))发掘 OFA/iLRP 蛋白序列所有已知的 HLA 结合基序。然而，将含有数据库中所有已知HLA结合基序的序列、起始位点和％最优结合(％匹配实验HLA结合数据)的表格存储在Excel中，而不是逐个地分析HLA结合基序。一旦获取了 HLA结合位点的数据，使用用于Mac OS X的I^rism 5. O (GraphPad软件公司)进行分析。 为寻找具有增加的HLA结合位点的区域，完成了若干不同的分析。首先，绘制了预测的HLA 结合位点的起始位点以显示具有增加的HLA结合可能性的潜在区域。然后，检查最优百分比(OPT)并对氨基酸的起始位点作图。最后，为寻找具有增加的HLA结合位点数目的区域， 对位点的数目进行分组(binned) (5氨基酸)。这些分析共同表明存在拥有更多HLA结合位点分布的特定区域。一旦鉴定了具有高数目HLA结合位点的区域，从Excel表单中提取这些区域的数据并且将％ OPT对所有预测的HLA结合区域作图。为分析与整个蛋白(所有HLA 位点)显著差异的区域，使用单因素AN0VA，随后进行Dimnets多重比较检验来分析所选择的肽区域。该分析显示了组间存在显著的差异(P = 0. 0068)。Durmets事后(post-hoc)分析显示了 132-134和211-217肽组与所有MHC肽的对照组有显著差异= ρ < 0. 05)(图 2)。使用在本文中描述的本发明的发掘方法，鉴定了可用于致敏免疫系统的肽。表1 提供了本发明的肽序列的实例列表。分析区域可假定地结合MHC蛋白的次数，可选择和/或组合肽区域来开发生物活性肽(图1)。使用对区域的分布分析和平均％ OPT分数，发现了五个区域具有更高的结合免疫系统适当组分的可能性。这使得可以用一系列不同的离体、 体外或体内刺激作用致敏患者来治疗OFA/iLRP相关的疾病。因此，在一个实施方案中，本发明的肽包括但不限于VLQMKEEDV、QMKEEDVLK、 QMEQYIYKR、GIYIINLKR、KLLLAARAI，、LLLAARAIVA、LLAARAIVA, LAARAIVAI, AAATGATPI、 TPGTFTNQI、RLLWTDPR、DPRADHQPL、QPLTEASYV、PLTEASYVNL、MLAREVLRM、LRMRGTI SR. EIEKEEQAA, EKEEQAAAEK、KEEQAAAEK、EEQAAAEKA、QAAAEKAVTK、AAAEKAVTK、VPSVPIQQF 和其混合物。可添加额外的氨基酸到所述肽或肽混合物的η-端和/或c-端。在另一个实施方案中，本发明的肽源自OFA/iLRP的二聚化区域。为了免疫刺激作用、稳定性和/或肽可溶性，本发明的肽可与适当的载体缀合。缀合的类型包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、生物学聚合物、抗体、化疗、 碳纳米管、微电子/电流体装置、分子机器、氨基酸MAP聚合物、树枝状聚合物、生物学活性脂质、生物学活性糖分子/聚合物、胶体颗粒、其它肽序列以及包括一系列蛋白质。用于缀合的半胱氨酸残基的位置可根据需要出现在末端或内部。缀合的目标是提高免疫系统抗癌症治疗活性或任意其它涉及OFA/iLRP肽的相关活性。本发明的肽序列可能略有变化以提供更高的免疫系统反应性、增加的可溶性和其它功能，并且这样的肽序列变化被视为本发明肽的一部分。此外，本发明的一或多种免疫反应性肽序列可被放置在一起以形成新的免疫反应性肽。所述序列可来自免疫活性高度可预测的区域或来自若干其它位点或蛋白质。此外，所述肽可用于阻断或增强与免疫系统无关的特定功能。可制造一或多个重复肽的串联肽以形成长的生物学活性聚合物。在制备期间，所述肽可以有一或多种修饰，包括但不限于乙酰化、制剂(formulation)、脂肪酸化、肉豆蔻酸化、棕榈酰化、苄氧羰基化、酰胺化、对硝基苯胺、AMC、琥珀酰化、NHS、CMK/FMK、 D-氨基酸、二硝基苯甲酰化、甲基化、磷酸化、S03H2、辛酸、生物素、FITC、GAM、丹磺酰化、 MCA、HYNIC、DTPA、成环、多抗原肽系统(MAP)和/或影响OFA/iLRP肽功能的其它修饰，其包括增加可溶性、稳定性、免疫反应性和/或生物学活性。本发明的肽可针对OFA/iLRP的特定区域，其在OFA/iLRP相关疾病或疫苗接种治疗期间可降低非特异性影响。所述肽由表1所示的肽序列或肽序列的组合制成。为确定具有免疫系统刺激作用的可能性增加的区域，设计了成簇的假定HLA结合位点，并且将平均％ OPT (与共有序列相比时肽的分数)[53，54]与OFA/iLRP中所有假定的HLA位点进行比较(图2)。图2中列出了用于比较的特别设计为包含多于一个假定HLA结合位点的肽的实例。单独的或组合的本发明的肽可用于以其提供的OFA/iLRP序列致敏免疫系统。设计为诱导针对OFA/iLRP的免疫应答的肽也可用于提供额外的临床应用，包括但不限于受体结合、阻断层粘连蛋白功能和/或影响其它的OFA/iLRP细胞功能。终产物可以是缀合的以提高OFA/iLRP肽的免疫反应性。缀合可以通过本文中描述的或本领域已知的不同方法形成，包括添加半胱氨酸来与马来酰亚胺(HiaIedioamide)KLH蛋白反应[55，56]。这些肽和其组合，可以在用于离体、体内或体外针对癌症的疫苗接种之前进行缀合或修饰。根据本发明的实施方案，基于计算机的方法鉴定了若干可能的蛋白质序列，其可用于树突状细胞和免疫系统治疗。在一个实施方案中，计算了设计于第132、117和M位氨基酸周围的3种肽的平均％ OPT (图2)。将所设计的肽与平均％ OPT分数进行比较，它们都高于平均值，其中132区域是显著差异的(图幻。所述肽拥有至少3个氨基酸的侧翼序列， 其不是HLA典型序列的部分并可被修饰(如果需要)以最优化抗原加工和HLA结合。其它可能的肽起始于第104和211位氨基酸周围并且可单独地或与其它肽组合应用。本发明的肽可用于在树突状细胞离体诱导和致敏中替代细菌表达的OFA/iLRP。所述肽可缀合于多种大分子，条件是它们适合于人或兽医学应用。 肽可通过化学合成或使用大肠杆菌等的生化合成制备。本领域技术人员熟知的方法可用于合成。当本发明的肽为化学合成时，可应用肽合成领域众所周知的方法。例如，可例举这样的方法如叠氮化物法、酸氯法、酸酐法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、羰基二咪唑法和氧化还原法。可使用固相合成或液相合成。也可使用商业化的肽合成仪(如Siimadzu PSSM-8)。反应之后，本发明的肽可通过组合常规纯化方法(如溶剂萃取、蒸馏、柱层析、液相色谱或重结晶)纯化。根据本发明的一个方面，肽可以包含在给对象施用的组合物中。该组合物可以是药物组合物或疫苗。药物组合物可以包含药物学可接受的载体。该组合物也可以是由本发明的肽致敏的树突状细胞。如本文中所用的，树突状细胞(DC)是加工抗原物质并将其呈递至免疫系统其它细胞的表面的免疫细胞，因此其起抗原呈递细胞的功能。可用不同的方法使树突状细胞对抗原致敏。在一个实施方案中，这些方法包括使树突状细胞与抗原肽接触(“肽脉冲处理”) 的步骤。该方法包括将树突状细胞与一或多种抗原肽(即源自抗原的肽)温育不同时间 (通常约30分钟至约5小时)，使得用所述肽处理获得抗原呈递细胞，也称为致敏的树突状细胞。用癌症特异性抗原处理树突状细胞可通过任意方法(当疫苗组合物或包含肽的组合物施用于哺乳动物时，其导致树突状细胞呈递抗原从而刺激宿主免疫)，例如通过在给哺乳动物施用疫苗组合物前在抗原存在下脉冲处理或培养树突状细胞。树突状细胞可通过可使树突状细胞到达适当的细胞的任何方法给哺乳动物施用。 这些方法包括，如，注射、输注、沉积、植入、口服或局部施用，或其任意组合。注射可以为， 如，静脉注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射或腹腔注射。在给定时间段内可以施用单一或多剂量，取决于癌症，其无需过多的实验即可由本领域技术人员确定。注射可在多部位进行。树突状细胞可单独地或组合其它治疗剂施用。如本文中所用，“疫苗”意指含有抗原的无害形式的生物体或物质。疫苗被设计为触发免疫保护性应答。疫苗可以为重组的或非重组的。当接种到非免疫宿主时，疫苗会引起对所述生物体或物质的主动免疫，但不会引起疾病。疫苗可采取以下形式，例如，类毒素， 其定义为已脱毒但仍保持其主要免疫原性决定簇的毒素；或灭活的生物体，如伤寒、霍乱和脊髓灰质炎病毒；或减毒生物体，其为活的但非毒力形式的病原体，或其可以是由该生物体编码的抗原，或其可以是活的肿瘤细胞或肿瘤细胞上存在的抗原。虽然疫苗组合物的剂量取决于抗原、物种、接种疫苗或将接种疫苗的宿主体重等等，在小鼠模型中，疫苗组合物药物学有效量通常范围为每千克体重每剂约50.mU. g到约 500. mu. g0作为一般规则，本发明的疫苗组合物方便地口服、胃肠外(皮下、肌肉、静脉、 皮内或腹腔)、口腔、鼻腔或透皮施用。本发明预期的施用途径取决于抗原物质和助剂 (co-formulant)0疫苗组合物的剂量取决于所选择的抗原、施用途径、物种、体重和其它标准因素。 预期本领域普通技术人员可以轻松并容易地滴定测量每种抗原的用于免疫原性应答的适当剂量以实现有效的免疫量和施用方法。本发明的组合物配制成与其预定施用途径兼容。施用途径的实例包括胃肠外，如静脉、皮内、皮下，口服(如吸入)，透皮(局部)，穿粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包含以下组分无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调整张力的物质，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节PH。 胃肠外制备物可封闭在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。适合于注射用途的组合物包括无菌水溶液(如果可溶于水)或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对静脉施用，合适的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在任何情况下，组合物必须是无菌的并应为流体的(达到易于注射的程度)。组合物在生产和储存的条件下应该是稳定的，并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质， 其包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。通过例如使用涂层(如卵磷脂)、维持需要的颗粒尺寸(就分散体而言)以及使用表面活性剂可保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如，糖或多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)可使得注射组合物的吸收延长。无菌注射溶液可通过在适当的溶剂中以所需的量引入化合物与上述列举成分的一种或组合而制备，根据需要，随后过滤消毒。一般来说，分散体可通过引入化合物到无菌容器中制备，其含有基本分散介质和所需的上述例举的其它成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从预先无菌过滤的溶液产生活性成分加上任意额外的所需成分的粉末。口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用的载体。为口服治疗施用的目的，组合物可掺入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊(如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物也可以用流体载体制备，用作洗口药。可包含药物学兼容的结合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任意下述成分，或具类似性质的化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或^erotes ；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘香精。对吸入施用，组合物以气雾喷雾的形式从包含合适的推进剂(例如，气体如二氧化碳)的压力容器或分配器或从喷雾器输送。全身施用也可通过穿粘膜或透皮方法。为穿粘膜或透皮施用，在配方中使用了适合于待穿透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域一般是已知的，并包括，例如对于穿粘膜施用而言，去污剂、胆盐、夫西地酸衍生物。穿粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾或栓剂实现。 对透皮施用，化合物配制成本领域一般已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。本发明的制备物还可以制备为用于直肠输送的栓剂(例如，与常规栓剂基质如可可脂和其它甘油脂类一起)或保留灌肠的形式。在一个实施方案中，组合物用保护化合物不会从身体迅速消除的载体制备，如控释制剂，包括植入物和微胶囊输送系统。可使用可生物降解的、生物兼容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法将会是本领域技术人员所熟悉的。所述物质还可以从Alza Corporation和 NovaPharmaceuticals, Inc.商购获得。脂质体悬浮物(包含靶向于被感染细胞的带有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药物学可接受的载体。以易于施用和剂量一致的剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物是有益的。本文中所用的“剂量单位形式”指物理上离散的单位，其适合作为用于待治疗的对象的单位剂量，每个单位含有经过计算以产生预期的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物学载体。本发明的组合物，可包含在容器、包装或分配器中，与施用指南一起形成包装好的产品。其它活性化合物也可以并入组合物中。本发明还提供了包含本发明的肽及药物学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。 药物学可接受的赋形剂为本领域已知的，为有利于药物学有效的物质施用的相对惰性的物质。例如，赋形剂可提供形状或稠度或起稀释剂的作用。合适的赋形剂包括但不限于，稳定剂、润湿和乳化剂、用于不同渗透压的盐、封装剂、缓冲液和皮肤穿透增强剂。赋形剂和用于胃肠外及非胃肠外药物输送的制剂阐述于Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000)。本发明提供了使用本发明的肽检测、诊断和监测以及治疗OFA/iLRP相关癌症的方法。为了本发明的目的，OFA/iLRP相关癌症指任何与OFA/iLRP表位表达(相对于正常样本增加或减少，和/或不适当的表达，如出现在通常缺乏表位表达的组织和/或细胞中) 相关的疾病、紊乱或病变。在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有OFA/iLRP相关癌症的对象的方法。该方法包括以足够减少OFA/iLRP相关癌症发展的量给对象施用本发明的肽(单独地或作为混合物)的步骤。所述肽可在对象中诱导减少OFA/iLRP相关癌症发展的免疫应答。免疫应答可包括T细胞或B细胞相关的应答。该肽还可诱导不依赖于免疫应答的应答。这类应答的实例可以是，但不限于活力、粘附、转移、血管化或其它可能不依赖于免疫应答的应答。在另一个实施方案中，治疗患有OFA/iLRP相关癌症的对象的方法包括步骤(a)用本发明的肽致敏树突状细胞，(b)以足够诱导免疫应答的量给对象施用已致敏的树突状细胞，所述免疫应答减少OFA/iLRP阳性癌症的发展。树突状细胞的致敏及施用在上文已讨论，在此不再重复。树突状细胞的实例包括但不限于单核细胞来源的细胞(CD 14+)、造血干细胞来源的细胞(⑶34+或⑶133+或⑶117+)、类浆细胞(⑶303+/⑶304+)、骨髓来源的细胞(CDlc+或 CD141+或 CD209+)或朗格汉斯细胞(Langerhans cell)。本发明的肽还可用于测定样品中针对OFA/iLRP的抗体的量的方法。该方法包括(a)在使得抗体与肽结合形成复合物的条件下使本发明的肽与样品接触，(b)测定样品中形成的复合物的量。可用常规方法测定具有抗体的复合物的量。实例包括但不限于，ELISA、荧光偏振、 共振、FACS或任何已知的能检测抗体的方法。在另一个实施方案中，本发明的肽用于监测对象中OFA/iLRP相关癌症的疫苗接种治疗的进展的方法。该方法包括步骤(1)向对象的部位皮下或皮内施用本发明的肽，以施用的量足以检测对象对所述治疗的免疫应答，(2)监测所述施用部位的反应直径。在另外的实施方案中，本发明的肽用于离体监测对象中OFA/iLRP相关癌症治疗的进展。所述治疗能够诱导T细胞相关应答或B细胞相关应答如抗体应答。该方法包括步骤(1)提供接受治疗的对象的生物流体，( 在使得肽与T细胞或B细胞或由T细胞或 B细胞产生的产物相互作用的条件下，使本发明的肽与所述生物流体接触，(3)通过ELISA、 荧光偏振、共振或FACS方法测定相互作用的量。为了本发明的目的，生物流体为任意的生物学流体或组织裂解液，其可被排泄、分泌、用针获得或作为病理过程的结果而出现。生物流体的实例包括但不限于，血液、尿、组织裂解液、血清、血浆、胆汁、汗液、唾液、胞囊液、水疱液、脓肿液、脑脊液或其它。T 细胞的产物包括但不限于，IL-2、IFN- y、TNF- α、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10、 T细胞受体、趋化因子、穿孔素、颗粒酶b、IL-9、IL-I β、GM-CSF, TGF- β、⑶4、⑶8、整合素、 MHC或其它。B细胞的产物包括但不限于，免疫球蛋白、BLAME、BTC、HVEM/TNFRSF14、IFNGR2、 IgG、IgM、IL-10、IL-13、整合素、DLF、LAX、白三烯、Lyn, LillrcU NFAMI、NTB-α、0X40L、 Pax5、PDCD6、WSX-1/L-27R、TER-119、TRA、TREML2、TSLP, Vav-UB 细胞受体、BAFF, CD79A、 CD40 配体、BCL-6、ADAM、IL-I1、IL-4、CD27、STAT 和其它。本发明的肽具有很多应用。下面列出一些应用作为实例。肽在树突状细胞治疗中的用途本发明的肽可用作树突状细胞治疗或离体免疫治疗的一部分。OFA/iLRP肽，单独地或联合KLH或其它免疫系统刺激剂、佐剂或其它分子，可用于引起离体免疫应答。“脉冲处理的”树突状细胞被注射回供体以提供可能能够减少所有形式的OFA/iLRP阳性癌症的发展的抗癌免疫应答。与KLH缀合的肽的初步效果可在细胞培养中利用细胞因子/趋化因子的表达测量。制备用于致敏的OFA/iLRP肽，并以分离自外周血、白细胞采集物细胞或棕黄层的单核细胞开始，从单核细胞产生树突状细胞[30，31]。单核细胞的分离和培养遵循标准方案，其使用完全RPMI-10 (含胎牛血清、15mM HEPES和IX抗生素/抗真菌溶液的RPMI 1640或类似物)[30-35]。单核细胞的分化和脉冲处理(暴露于抗原)将根据标准方法完成[13]。可在细胞培养基中测量Y-干扰素(Y-IFN)的产量作为树突状细胞致敏和成熟的度量。细胞培养基中Y-IFN的提高(统计学地高于未刺激的对照细胞)被视为由OFA/ iLRP肽刺激的阳性树突状细胞。之前的研究使用了若干不同的细胞因子组合，可测定多细胞因子或趋化因子以提供完整的细胞因子全景(landscape)。可实施额外的使用分子表达差异聚类的分析来确定细胞刺激之前、细胞刺激期间和细胞刺激之后的免疫细胞亚组。动物模型可用于确定不同的肽在注射后对体内细胞因子全景的确切效果。这也将为扩展到人类治疗的设想提供证据。若干模型系统(即细胞培养、健康供体全血和动物模型)的组合将提供数据来使OFA/iLRP肽模型发展为人抗癌症治疗。之前已使用肽脉冲处理人树突状细胞[23]；然而，除了一个例外，所使用的区域是不同的。之前的工作使用了起始于第58位氨基酸的肽[23]，而这里的肽由于非常特殊的原因起始于氨基酸M。首先，为了更好的可溶性和其它与三个非极性疏水残基有关的问题[23]而选择该起始位点。其相邻的氨基酸拥有非极性的侧链，因此，选择苏氨酸作为起始氨基酸。此外，电荷的缺乏和序列的变化可能足以影响结合，其反过来可影响MHC结合潜力[53,54,57]ο肽作为树突状细胞患者免疫应答工具的用途根据本法明的另一个方面，本发明的肽，例如在表1中列出的肽，可用于监测使用 OFA/iLRP的癌症疫苗接种治疗的进展。在一个实施方案中，单独的片段可皮下或皮内注射以监测患者的免疫应答。注射后，监测该部位的应答并测量反应直径。如果多于一种肽用于致敏，可存在多个注射部位并且可对反应进行比较。如果所述肽缀合于KLH或类似的物质，缀合物可单独用作免疫应答的阳性对照。当存在多于2或3种致敏肽/试剂待测试时， 所述肽可用于修改的皮肤划痕测试、皮肤点刺测试或皮肤斑贴测试(与Mantoux/PPD测试类似)[36]。用于皮肤点刺测试的肽可制备于一系列稀释液中以及用一系列来自OFA/iLRP、 KLH (或其它缀合物)或任意其它用于树突状细胞/癌症免疫治疗的蛋白质的不同的肽来制备[13，27]。稀释度和/或不同的肽可用于反映(map)个体的免疫应答并用于致敏免疫系统。如果蛋白质(代替肽)用于致敏患者，修改的皮肤斑贴/点刺测试可用于寻找该个体的免疫反应表位。合成来覆盖蛋白质假定的MHC-I或2的肽(6到30个氨基酸)可用于致敏 /疫苗接种患者。可以与选择OFA/iLRP肽类似的方式选择该肽。可选择地，可合成覆盖了蛋白质序列的肽文库并用于测定表位和反应的量。针对肽和对照溶液的免疫应答可通过可获得的皮肤斑贴测试试剂盒施加器来划伤/点刺皮肤而同时测定。或者，可在针上“装载” 适当的肽或对照溶液并可测试一块皮肤。免疫反应最快可在20分钟内出现。然而，反应可能在接种后1周期间发生，尽管最大的过敏反应倾向于在接种后M-72小时内发生。一旦确定了肽的反应和最优稀释度，医生可利用标准测试确定树突状细胞或疫苗治疗的规模和等级。该测试与用于结核病的结核菌素或核菌素/PPD测试类似[36]。迟发过敏性反应提供的信息将表明树突状细胞或疫苗接种是有效的以及患者对靶表位有多敏感。在另一个实施方案中，本发明的肽可用于通过离体定量细胞因子应答来测定由树突状细胞或疫苗接种治疗引起的免疫反应的程度。为了实施离体细胞因子应答的测量，抽取患者的血并通过甲泛葡胺梯度、Ficoll梯度或低渗裂解红细胞来分离白血细胞。洗涤所得的WBC并置于适当的生长培养基中。所述细胞在含5%二氧化碳的湿润环境下于37°C温育。18-M小时之后，使细胞生长于单独的平板或多孔平板上，其可用一系列来自OFA/iLRP 的肽稀释液或任何其它树突状细胞或疫苗接种治疗来“激发”(challenge)。如上述温育至72小时后，分离细胞培养基并用标准ELISA或多重ELISA技术测定细胞因子/趋化因子的表达。一些可用于测定免疫活性的细胞因子表达包括但不限于GM-CSF、IFN- y , IL-4、 IL-10、TGF-a ,TNF-a、IL-6、IL-2和/或IL-12。若干其它常用的技术可应用于测定OFA/ iLRP和OFA/iLRP肽治疗的免疫应答[37-40]。肽作为疫苗的用途本发明的肽，例如在表1中所列出的肽，可单独地或以缀合状态用作体内疫苗。它们可直接注射进个体以提供针对癌症的保护(包括预诊)或帮助减慢现有癌症的发展。所述肽与适当的底物缀合以赋予适当的体内疫苗接种应答。个体通过肌肉内、皮内、血管内、 口服或通过任何其它常用的途径/机制暴露于OFA/iLRP肽。一旦被注射，个体的免疫系统发起适当的免疫应答以抵御OFA/iLRP阳性癌症和可能的其它OFA/iLRP相关疾病。疫苗接种对以下是有用的(i)降低患OFA/iLRP阳性癌症的可能性；(ii)对于局部化形式的OFA/iLRP阳性癌症，在治疗后降低复发率；(iii)帮助增强目前化疗、放射同位素植入 (radionucleotide-seeding)或基于放射性的癌症治疗；(iv)帮助减慢晚期癌症的发展； (ν)增强通过OFA/iLRP致敏的树突状细胞治疗的免疫力。所述肽可注射进动物，以在一系列致敏和/或针对OFA/iLRP的最小效价后针对 OFA/iLRP致敏。作为非特异性免疫系统影响的对照，对照动物可针对匙孔槭血蓝蛋白致敏。 在适当系列的致敏后，可通过注射OFA/iLRP阳性癌细胞到已致敏动物尾静脉中对动物进行“激发”。所注射的癌细胞将定殖于动物的肺中。针对OFA/iLRP致敏的动物在肺中应该拥有相对未处理的动物更低数目的癌集落(colony)。或者，可使用其它动物模型/度量。然而，使用免疫功能低下的动物的系统由于治疗的性质而可能无法工作。多数动物癌症模型的问题是其使用SCID、血液学来源或缺乏完整功能的免疫系统的其它系统。然而，OFA/ iLRP癌症治疗先前已成功地在动物中建立模型W，9，11，18，23，41-43]。由于本治疗的免疫性质，需要有功能的免疫系统。存在可选择的方法来测定这些肽针对OFA/iLRP阳性癌症的治疗价值。可应用若干其它常用的技术测定OFA/iLRP和OFA/iLRP肽治疗的免疫应答 [37-40]，其中的相关内容通过引用并入本文中。肽用于治疗OFA/iLRP相关癌症的用途本发明的肽，例如在表1中列出的肽，单独地或组合地，可以缀合或非缀合形式用于通过可能不依赖于免疫系统或与免疫系统协同的作用改变涉及OFA/iLRP的疾病的发展。例如，OFA/iLRP的肽G区域已显示为通过层粘连蛋白受体的稳定化在转移中发挥功能 [16，M，44]。表1中列出的肽，包括其突变和/或修饰的形式，可通过影响OFA/iLRP的活性而用作药剂。在一个实施方案中，本发明提供了测定对哺乳动物及非哺乳动物细胞的生长速率的药理学效果测试。该测试包括以下步骤使细胞在有或无不同浓度的本发明的肽的条件下生长，测量对细胞凋亡、细胞坏死和细胞增殖的影响。可将OFA/iLRP阳性癌细胞体外生长于具有多种剂量的本发明肽的不同基底膜上。肽的效果可通过不同的方法测量， 其包括但不限于，DNA梯形条带、细胞死亡检测ELISA、半胱天冬蛋白酶测量、TUNEL测定、 Annexin-V膜改变、DNA染色、FAS、p53、细胞毒性测定、细胞增殖和细胞活力。所述肽可用于提高或降低OFA/iLRP阳性癌细胞的侵袭性。这可通过在多种浓度， 有和无所述肽的条件下使OFA/iLRP阳性细胞生长，使用与若干涉及其它蛋白质的研究类似的修改的Boyden-chamber来测量[45_48]。所述肽还可用于影响细胞粘附并可用标准方法测量。例如，粘附培养的OFA/iLRP阳性癌细胞在不同的胞外基质蛋白(ECM)存在下和肽一起培养。然后通过标准方法测定细胞来确定肽存在时细胞系的相对附着W9-52]。若干其它常用的技术可应用于测定OFA/iLRP对细胞活力、细胞增殖、细胞死亡和细胞凋亡的影响[37-40]。肽用于监测OFA/iLRP相关疾病的用途本发明的肽可用于监测对OFA/iLRP相关疾病的离体或体外应答。例如，表1中列出的肽，单独地或组合地，以缀合或非缀合的形式，可用于测定对疾病治疗的身体应答的程度。在表1中列出的肽可包被在固体基质上(单独地或组合地)并且细胞应答、自体免疫抗体的存在、结合蛋白的出现和/或其它测试可用于测定对树突状细胞治疗的应答。肽用于表位检测和免疫球蛋白定量的用途所述肽可用作体外表位检测及免疫球蛋白定量的底物。表1中列出的OFA/iLRP 表位可包被在乳胶珠或颗粒上并可用于使用凝集反应筛选患者血清。简而言之，表1中所列出的肽可附着于颗粒如乳胶或胶体上。所述肽/颗粒混合物可与患者血清温育来测量存在的与OFA/iLRP肽反应的免疫球蛋白相对量。如果只有一种肽试剂用于致敏树突状细胞， 那么该肽就是唯一所需的。如果全长蛋白质试剂用于致敏树突状细胞，那么可预测如表1 所列出的肽的一系列肽。为降低聚类的肽区域的总数目，可如上述组合MHC肽预测。这些肽单独地缀合于乳胶珠、胶体或颗粒，并用于凝集反应研究。为测定反应性，将稀释或非稀释状态的患者血清转移至具有约25mm直径的蜡圈的血清学玻璃盘上，或转移至特别设计为血清温育模板的平台上。血清可与适当量的肽/颗粒混合物温育。血清、肽/颗粒混合物应在水平平台上不断地旋转以防止非特异性凝集反应。测试可包括阳性血清和阴性对照血清。在室温旋转并温育15分钟至2小时后，读取凝集反应并根据凝集反应程度分级。在某些情况下，可加入额外的抗人抗体以提高非IgM分子的灵敏度和检出率。这是上述凝集反应测试的扩展并称为“间接凝集反应”。此外，IgM(直接凝集反应)对IgG(被动凝集反应)的比可提供患者疫苗接种状态的临床相关信息。这种技术可应用于任何树突状细胞治疗或癌症疫苗，其中患者对特定表位的免疫需要快速地测定并参考分级量表进行解释。作为凝集反应评分的替代物，测试可采取分光光度计、化学发光、放射性、电子或荧光定量。若干其它常用的技术可应用于测定OFA/iLRP和OFA/iLRP肽治疗的免疫应答[37-40]。肽在酶联免疫测定(ELISA)中的用途本发明的肽可用于ELISA测定。ELISA测定可用于定量和/或检测可溶性抗原或抗体。另外，使用不同的肽来制造针对不同的OFA/iLRP肽的特异性单独应答。第一种应用是将所述肽用作针对接受OFA/iLRP治疗的患者血清的抗原。该方法遵循标准方案[40]。 第二种方法将是所述肽的另一种新型的应用，其作为标准直接竞争性测定法来测定循环抗原。该方法遵循标准方法，但使用本发明的肽W0]。下面的实施例是为了说明而不是限制本发明的范围。虽然这样的实施例是那些可能被使用的典型实施例，仍可选择地利用本领域技术人员已知的其它步骤。事实上，基于本文中的教导，本领域普通技术人员无需过多的实验即可容易地设想并产生进一步的实施方案。实施例1肽预测及与OFA致敏的树突状细胞结合使用基于计算机的聚类方法预测了若干区域(图幻。选择了起始于第1 位氨基酸的区域(Ac-CADHQPLTEASYVNLPT-酰胺)，因为其可用于进一步显示肽修饰的效果。此外， 1 位于已显示为不含有表位并缺乏YVNLPTIAL表位的一半(以前的研究显示为必须的) 的区域中{Rohrer，2006#l}。为确定1 区域是否具抗原性，用全长的重组人OFA脉冲处理树突状细胞，使其成熟并用荧光标记肽分析1 表位(图3A和C)。⑶14+单核细胞以每毫升IXlO6个细胞生长于含有1000IU/ml GM-CSF和 1000IU/ml IL-4(细胞Genix Antioch，IL)的无血清树突状细胞培养基中。用100ng/ml的 rHu OFA或以下肽的等量混合物(20ng/ml)脉冲处理细胞36小时(129)CPRADH0PLTEASYVNLPT-0H ；(117) FREPRLLffTDPRADHQPLTEAC-酰胺；(101)CGRFTPGTFTNQIQAAFREPT-OH ；(208) Ac-EEIEKEEQAAAEKAVTKEEFQGC-酰胺(54) TffEKLLLAARAIVAIENPADVC-酰胺。用无血清的树突状细胞培养基使已脉冲处理的树突状细胞成熟，所述培养基含有 10ng/ml IL-lbetaU000IU/ml IL_6、5ng/ml TNF-α 和 1 μ m 前列腺素 Ε2 ；成熟 2 天。在两天结束时，从平板刮下细胞并用流式细胞仪分析(图3A-B)。遵循标准程序完成对起始于第1 位氨基酸的表位的荧光标记，例如，遵循标准方案加入首先标记于半胱氨酸的肽使得可以使用荧光素-5-马来酰亚胺(Pierce/Thermo，Rockford, IL)缀合。使用标准染料去除柱(Pierce/thermo，Rockford, IL)去除未结合的荧光素。为确定成熟是否成功，用⑶14、⑶80/86和Class II MHC(HLA-DR)遵循标准方案分析细胞(R&D系统；Minneapolis，MN)。简单地说，每管5. OX IO5个左右的细胞重悬于含 2%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中。细胞放置于冰上并且将25μ 1的合适抗体、荧光素标记的肽或同种型对照抗体与细胞在冰上温育1小时。一小时后每管加入細1含2% FCS的 PBS,并且通过以300X g离心10分钟沉淀细胞。在400 μ 1含2% PCS的PBS中重悬细胞并分析(图:3B)。如果不能立即分析细胞，在黑暗中于4°C将其固定在0.5%甲醛/PBS中。如果细胞为⑶14阴性并且为⑶83、⑶80/86和Class II MHC阳性，则被认为是树突状细胞。
图3显示了具代表性的树突状细胞FACS分析，所述细胞用全长重组人OFA/ iLRP(图3A)或源自OFA/iLRP的HLA计算分析的肽的等量(质量)混合物脉冲处理(图 3B)。数据显示rHu OFA/iLRP和所述肽都能有效地脉冲处理树突状细胞。ArHu OFA/iLRP 致敏的细胞识别为53. 90士3. 058 N = 4，而肽混合物脉冲处理识别为40. 43士2. 618 N = 4，差异为13. 48 士4. 025 (图3C)。使用双尾学生t_检验来确定识别OFA/iLRP的129区域的成熟树突状细胞的百分比之间是否存在显著的差异。发现组之间的差异为显著的(P = 0.0155)；平均值+/-SEM和显著性O示于图3C。
数据表明53. 9%的用rHu OFA/iLRP脉冲处理的树突状细胞识别了 1 区域表位 (图3A)并且表明计算分析对于预测以前未鉴别的表位是准确的。作为该区域强度的额外证据，大部分脉冲处理的树突状细胞识别了该区域。所述肽刺激树突状细胞的能力示于图 3C，有40. 43%的细胞识别1 区域。可预期将有约40%的树突状细胞应识别1 区域，因为117肽具有重叠序列，其用下划线区域表明。这表明用OFA/iLRP肽脉冲处理树突状细胞可用于调节对全长蛋白特异区域的免疫应答。此外，这些实验表明荧光形式的肽可用作致敏和诊断试剂。
实施例2
肽修饰对树突状细胞结合129区域的影响
使用基于计算机的聚类方法预测了若干区域(图幻。选择了起始于第1 位氨基酸的区域(Ac-CADHQPLTEASYVNLPT-酰胺)，因为其可用于进一步显示肽修饰的效果。为确定1 区域是否可提高其与树突状细胞的相对结合，对肽序列进行了修饰，在羧基端包括4 个额外的氨基酸并在氨基端包括6-氨基己酰作为间隔物以最小化结合障碍。与标准1 肽相比，这些修饰应当增加平均荧光强度。
CD 14+单核细胞以1x106个细胞每毫升生长于含有1000IU/ml GM-CSF和1000IU/ ml IL-4(细胞Genix Antioch，IL)的无血清树突状细胞培养基中。用100ng/ml的rHu OFA 脉冲处理细胞36小时。用无血清的树突状细胞培养基使脉冲处理的树突状细胞成熟，所述培养基含有 10ng/mlIL-lbeta, 1000IU/ml IL_6、5ng/ml 的 TNF-α 和 Ιμπι 前列腺素 Ε2 ；成熟2天。在两天结束时，从平板刮下细胞并用流式细胞仪分析。
肽129 和 129-a (Ac-TDPRADHQPLTEASYVNLPT-Ahx-C-酰胺)的荧光标记遵循标准步骤完成。简而言之，加入标记于半胱氨酸的肽使得可以遵循标准方案使用荧光素-5-马来酰亚胺(Pierce/Thermo，Rockford, IL)缀合。使用标准染料去除柱(Pierce/Thermo， Rockford, IL)去除未结合的荧光素。半胱氨酸也可用于将肽与一系列不同的产物缀合。16
为确定成熟是否是成功的，用⑶14、⑶83、⑶80/86和Class II MHC(HLA-DR)遵循标准方案分析细胞(R&D系统；Minneapolis，MN)。简而言之，将每试管0. 5X IO5个细胞悬浮于25μ 1含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中。细胞放置于冰上并且将25μ 1的合适抗体、荧光素标记的肽或同种型对照抗体与细胞在冰上温育1小时。一小时后每管加入細1 含2% FCS的PBS，并且细胞通过以300Xg离心试管10分钟沉淀。在400 μ 1含2% PCS的 PBS中重悬细胞并分析。如果不能立即分析细胞，黑暗中于4°C在0. 5%甲醛/PBS中将其固定。用BD LSR II分析仪分析至少2000个事件并且用FACSDiva软件版本6. 1. 3显示(图 4A-B)。如果细胞为⑶14阴性并且为⑶83、⑶80/86和HLA-DR阳性，则被认为是树突状细胞。
图4D显示，用重组人OFA/iLRP脉冲处理的树突状细胞具有针对1 表位的活性并且有更高的与修饰的结合的可能性。1 肽具有11，390+/-500. 6的平均荧光强度 (MFI)，而129-a肽显示了 38，670+/-5067的MFI或荧光强度3. 4倍的提高。代表性的FITC 标记的1 和肽分别显示于图4A和B中，通过t-检验确定是否具有与1 不同的结合谱(P = 0.0032)，表明对肽的修饰(通过使用接头残基(Ahx)或额外的肽)提高了其荧光强度(图4D)。提高的MFI表明了增加的结合能力。
该数据表明，轻微的变化可影响肽的结合及荧光强度。所述肽可用于致敏树突状细胞和测定树突状细胞脉冲处理的效率。该数据表明，针对OFA/iLRP蛋白质设计的肽的用途可通过一系列不同的方法轻微地修改以改善脉冲处理效率、结合活性、免疫刺激作用和免疫细胞定量。肽可单独地或在混合物中用于测定免疫细胞/蛋白针对特异的OFA抗原的反应性。
实施例3
hnocyte 96孔细胞粘附实验
本实验的目的是测定针对OFA/iLRP设计的肽对粘附细胞系对细胞外基质组分的细胞粘附是否具有任何影响。期望的应答是不存在粘附的变化，因为降低的粘附可提高转移潜力。
所有细胞在37°C的湿润室中(Mediatech，Inc. Manassas, VA)生长于含L-谷氨酰胺、1001. U.青霉素、100 μ g/ml 链霉素和 10%胎牛血清的 RPMI 1640。DU-145 和 SK-MEL-28 细胞从美国典型培养物保藏中心获得(ATCC，Manassas，VA)并遵循标准流程在培养基中生长。细胞生长至75到85%密度之间，遵循标准方案收集并用修改的Neubauer brightline 血球计计数，以400，000细胞/ml悬浮。
将肽溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBQ或DMSO中，然后加入PBS至最高含20 % DMS0， 制得2X溶液，并放入完全培养基中。肽稀释至适当浓度后，将50μ 1连同50μ 1细胞 (20, 000细胞/孔)一起分装到试剂盒提供的96孔测定板，所述测定板以2X8孔条提供，其包被了层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白III和胶原蛋白 IV(EMD，Gibbst0Wn，NJ)，然后在细胞培养温育器中37°C温育2小时。晃出内容物至生物废物容器中，向每孔中加入200 μ 1 PBS轻轻洗涤，晃出内容物到废物容器中，重复该步骤至共洗涤2次。下一步，向每孔加入100 μ 1 Calcein-AM工作溶液并在温育器中于37°C温育1 小时。遵循标准荧光方案使用DTX880 (Beckman公司)在485nm激发以及520nm发射波长下测量每个孔的荧光。
图5显示层粘连蛋白I和胶原蛋白I的孔的数据。没有看到所述肽在以生物学活性浓度存在时这些细胞的粘附有显著差异。所有基质的数据是类似的(没有显示)。
该数据表明所设计的OFA/iLRP肽不影响细胞粘附。因此，由于不影响粘附，它们不应通过降低癌细胞的粘附而增加转移负荷。这意味着所述肽能够具有体内临床/治疗用途，其不应增加患者的转移负荷。
实施例4
OFA/iLRP肽对细胞活力的影响
本实验的目的是测定针对OFA/iLRP设计的肽是否对细胞活力有任何影响。由于 OFA/iLRP的性质，预期所述肽设计为破坏OFAlOFA至LR转换或抑制其它蛋白|蛋白相互作用。
所有细胞在37°C的湿润室中(Mediatech，Inc. Manassas, VA)生长于含L-谷氨酰胺、1001. U.青霉素、100 μ g/ml链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640。DU-145细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)获得并遵循标准方案在培养基中生长。DU145 细胞生长至75到85%密度之间，遵循标准方案收集，并用修改的Neubauer brightline血球计计数，以400，000细胞/ml悬浮。
将肽溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBQ或DMSO中，然后加入PBS至最高含20 % DMS0， 制得2X溶液，并放入完全培养基中。肽稀释至适当浓度后，将50μ 1连同50μ 1细胞 (20, 000细胞/孔)一起分装到96孔检测板中，所述检测板用层粘连蛋白/巢蛋白复合物 (50μ 1/ml)包被或未处理(黑色带透明底)(Corning Life Sciences, Corning, NY)，过夜生长。然后细胞加入 20 μ ICellTiter-Blue (Promega, Madison, WI)并在 37°C额外温育 2 个小时。遵循标准荧光方案使用DTX880 (Beckman公司)在0. 001秒的积分时间下读取细胞。为确定半胱天冬蛋白酶活性是否被诱导，使用ApoOne测定法(ftOmega，Madison, WI) 测定半胱天冬蛋白酶3/7活性。数据输出至Excel并随后输出至I^rism 5. 0 (GraphPad软件公司)中作图，并使用单因素ANOVA来分析其与背景对照(用于肽的稀释剂)之间的统计学差异。
所有的DU145细胞生长于未包被或包被了层粘连蛋白/巢蛋白的96孔板。在肽 1或肽3(表幻存在时，在未包被组(无层粘连蛋白)或包被组(层粘连蛋白)中，对照与处理组之间都没有统计学差异(图6A和C)。然而，需要层粘连蛋白存在的肽所引起的任何可能的影响有一个有趣的趋势。肽2(表幻显示了最显著的生物学效果，其具有降低细胞活力超过2倍的能力并且和对照有显著的差异(P<0. 05)(图6B)。在ApoOne半胱天冬蛋白酶3/7测定中没有看到任何组有显著的差异(数据未显示)。此外，针对先前所描述的 OFA/iLRP表位(稀释于DMS0/PBS中的氨基酸49-60)制备的肽尽管能够增殖T细胞，却不能影响细胞活力或诱导细胞凋亡(数据未显示)。
本实验的目标是测定任何预测为具有免疫活性的OFA/iLRP肽是否对细胞活力有任何影响。当DU145细胞在肽2存在的条件下生长时，对比于肽稀释液对照(20% DMS0/80%的PBS)，肽2似乎对细胞活性具有显著的影响。然而，这不依赖于半胱天冬蛋白酶3/7激活并且在ApoOne法中没有见到显著的变化(数据未显示)。此外，之前显示为良好表位的肽(Rohrer，2006#l)不影响细胞活力(氨基酸49-60，数据未显示)。这表明，所述肽可能具有治疗活性，从而使得其能够用于免疫方法或可能的细胞活力靶方法。
可以不偏离本发明的精神和范围做出如前文中所阐述的许多修改和变化，并因此只应如所附权利要求书所表明的进行限制。
所有在本说明书中引用的的专利和参考文献以其整体通过弓I用并入本文。
表1.用于树突状细胞治疗的假定OFA/iLRP序列的初始筛选。列出的序列可单独或联合地用于树突状细胞治疗或其他临床应用的免疫刺激作用。


本发明涉及制造肽或肽混合物的方法，所述肽或肽混合物可用于针对癌胚胎抗原/未成熟层粘连蛋白受体蛋白(OFA/iLRP)脉冲处理树突状细胞。更具体来说，树突状细胞可以来自一系列不同的来源，其可指导免疫系统攻击特定抗原。一旦致敏，无论离体、体内或体外，树突状细胞将帮助个体自身免疫系统防止或治疗所有类型的OFA/iLRP相关癌症。所述肽还可用于检测、诊断和监测以及治疗OFA/iLRP相关癌症。