一种β-氨基己糖苷酶A酶活性检测方法、底物和试剂的制作方法【技术领域】,同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定氨基己糖苷酶A ( β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的方法,同时本发明还提供了一种作为β-氨基己糖苷酶A ( β -HexosaminidaseA, EC 3.2.1.52)的酶活性检测的底物,此外本发明还提供了测定β-氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活性的试剂。[0002]溶酶体是人体细胞内一种由单位膜包裹的细胞器,内部含有多种酸性水解酶,目前已发现的有60多种,如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶类。在细胞内溶酶体酶控制着多种内源性和外源性大分子物质的消化,如核酸、蛋白质、脂质、多糖及糖原等,因此,溶酶体又被称为细胞内的消化器官。人体每天的新陈代谢会产生许多人体不需要的大分子物质,如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等,这些大分子物质需经过溶酶体酶处理后水解成小分子物质方能继续参与机体代谢或排出体外。如果溶酶体内某种水解酶的活性降低或缺失将会导致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积,从而使得溶酶体发生肿胀,细胞变得臃肿失常,细胞功能受到严重影响,最终导致一系列疾病,这类疾病统称为溶酶体忙积症(Lysosomal Storage Diseases,简称LSDs)。依忙积的大分子物质种类差异将溶酶体贮积症分成以下几种主要类型:黏多糖贮积症、糖原累积病II型、黏脂质贮积病、神经鞘脂贮积病、糖蛋白贮积症等。[0003]据欧美国家初步统计资料表明,溶酶体贮积症作为一个整体,在新生儿中患病率可闻达1/8,000~1/5,OOO0目如在中国尚未进彳丁筛查统计,但随着生化检测技术的提闻,国内溶酶体贮积症的检出率明显提高,且呈逐步上升趋势。[0004]Tay-Sachs病是一`种常染色体隐性遗传性疾病,又称为B型GM2神经节苷脂沉积病,属于神经鞘脂贮积病的一种,是由于己糖胺酶a链缺陷、GM2在神经元累积所导致,导致GM2神经节苷脂分解代谢异常,而在体内(脑、眼、肝、脾和骨髓)中累积,影响细胞功能。[0005]根据起病年龄和临床表现可分为婴儿型、晚发婴儿型和晚发(儿童、青春期、成人)型二种。[0006]本病可见于世界上任何种族,但发病率不同。西亚和东欧的犹太人发病率最高,几乎比其他民族高100倍。国内尚无Tay-Sachs病的流行病学资料,但随着生化检测技术的提高,Tay-Sachs病的检出率明显提高。[0007]Tay-Sachs病确诊困难表现在多方面:首先因该病是多系统疾病,涉及遗传、神经、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系统,症状表现复杂,并且与多种常见疾病有相似的临床表现,因此医生很难从症状表现上积累诊断经验,因此漏诊、误诊及延误诊断的发生是普遍存在的问题。其次医院现有的各项常规检查等辅助手段均难以达到确诊的目的,如骨髓穿刺、体格检查、心电图、脑电图、B超、CT/核磁、X线、肌肉活检、血清肌酸磷酸激酶检查等诸多检查方法均无法对Tay-Sachs病的真正致病因素加以分析,因此不能对患者疾病作出准确诊断。基因检测困难重重,因单核苷酸序列多态性的存在,可能某些突变就是正常的,不会引发疾病,因此给分析带来不确定性;另外由于酶的活性还与其他一些参与酶功能的基因有关,有很多这类基因目前还未被研究人员发现,因此基因检测同样不能作为诊断的可靠依据。
[0008]导致Tay-Sachs病产生的直接因素就是患者体内单一 β -氨基己糖苷酶A酶活性降低或完全缺失,而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关,因此判断患者β -氨基己糖苷酶A的活性是否正常,同时结合患者的临床症状表现,就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。因此β_氨基己糖苷酶A酶活性检测作为Tay-Sachs病的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势,临床上通过对疑似Tay-Sachs病患者进行β -氨基己糖苷酶A活性检测,可以实现早诊断、早治疗,对Tay-Sachs病预后,减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测β_氨基己糖苷酶A活性是辅助确诊该病的最佳手段。本发明就是基于这些技术背景和社会现实需求,根据β_氨基己糖苷酶A的酶催化活性的特点,设计合成含有荧光基团的β_氨基己糖衍生物作为酶催化反应的底物,从而可以快速灵敏的测定待测样本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。待测样本中的氨基己糖苷酶A可以将含荧光基团的β-氨基己糖硫酸盐水解后释放出荧光分子和β-氨基己糖硫酸盐,其水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比,这样就可以计算待测样本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点,便于推广应用。
[0009]本发明要解决的技术问题是:提供一种快速、准确可靠的氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的荧光检测法,同时本发明还提供用于荧光法测定β -氨基己糖苷酶A活性的检测试剂,采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用,而且检测灵敏度高,特异性高,操作简便,因而可以得到切实的推广使用。
[0010]为解决技术问题 ,本发明提供的技术方案如下:
本发明的β-氨基己糖苷酶A酶活性测定方法原理如下:
R-β-氨基己糖硫酸盐+ H2O 3-観己糖苷酶aR-OH + β-氨基己糖硫酸盐。
[0011]具体为:β -氨基己糖苷酶A在特定条件下能够水解合成的本身无荧光的底物R-β-氨基己糖硫酸盐,释放游离的荧光分子R-0H,在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光,由于β -氨基己糖苷酶A水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比,因此检测在特定激发波长和发射波长下的R-OH荧光值,就可以计算出β -氨基己糖苷酶A的酶活力。
[0012]β -氨基己糖硫酸盐(β-Hexosamine sulphate salt)通用的结构式为:
一种β-氨基己糖苷酶A酶活性检测方法、底物和试剂制作方法
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