专利名称：一种野菊花有效部位及其应用的制作方法乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)持续复制而引起的一种传染性肝脏疾病，是目前传染性最强、发病率最高、危害最大的一种病毒性疾病。我国为“乙肝”大国，乙肝携带者超过I. 2亿人，由乙肝导致的肝硬化、肝癌的病死率在我国位居第五位，被称为“沉默的杀手”，但至今国内外对乙型肝炎仍缺乏有效的控制手段和彻底的解决方案，也无特效药，因此对有效治疗乙肝药的研制和开发，有着重大的社会意义和现实意义。中药因其对多种病毒性疾病整体效果明显、抗病毒作用机制多样、且不容易产生耐药性而成为国际关注的焦点和热点。野菊花为菊科(Compositae,Asteraceae)菊属(Dendranthema)多年生草本植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)、北野菊(Chrysanthemum boreale Mak.)或岩香菊(Chrysanthemum lavandulaefolium(Fisch. )Mak.)的头状花序。历代医家认为野菊花“入肝经”，具有“清热解毒、疏肝明目”的作用，临床运用广泛，特别多用于治疗各种炎症、病毒性疾病、心血管疾病等，包括慢性咽炎、前列腺炎、盆腔炎、传染性软疣、病毒性肝炎、高血压等。国内外学者发现其粗提物具有抗菌消炎解热、抗病毒、降血压、免疫调节、抗氧化等多种药理作用。而我们通过研究发现野菊花的醇提物具有较显著的抑制乙肝病毒的作用，并通过优化提取工艺研究，得到一个具有抗乙肝病毒和肝保护作用的活性部位，目前国内外尚未见有报道。
本发明的目的是提供一种野菊花有效部位，具有抗乙肝病毒和肝保护的作用。本发明的另一目的在于提供一种野菊花有效部位在制备抗乙肝病毒药物中的应用和在制备护肝组合物中的应用。为了实现以上目的，本发明野菊花有效部位所采用的技术方案是采用如下步骤的方法提取而成的野菊花有效部位I)取野菊花，加入5 10倍重量的60 90%乙醇提取，提取液过滤后将滤液浓缩至浸膏；2)将浸膏加水制成混悬液，加入萃取液进行萃取，回收萃取液得到野菊花有效部位，其中萃取液采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇中的两种或三种，萃取过程中石油醚、乙酸乙酯、乙醇用量的体积比为40 10 :5 I :1 O。步骤I)所述乙醇提取前对野菊花进行物理破碎。步骤I)所述提取次数为三次，所述提取液为三次提取的合并液。步骤2)所述萃取的次数为三次以上。通过实验证明，本发明的野菊花有效部位具有抗乙肝病毒和肝保护的作用。活性部位主要包括倍半萜类和黄酮类化合物。其中，总倍半萜含量> 45%，总黄酮含量> 35%，蒙花苷彡0. 65%，木犀草素彡0. 55%，豚草素A (cumambrinA)彡2. 90%，芹菜素彡0. 50%，刺槐素> 0. 10%,当归酸膝草素 B (angeIoylcumambrinB) ^ 0. 50%。本发明利用IfepG2. 2. 15细胞作为平台，研究了本发明野菊花有效部位(CIC)的体外抗HBV作用。采用MTT法检测细胞毒性并计算得TC50 ;采用ELISA法检测对细胞上清液中HBsAg、HBeAg表达的影响。结果表明本发明的野菊花有效部位对乙肝病毒具有较为明显的抑制作用。本发明通过实验证实了本发明的野菊花有效部位，可以抑制肝损伤的肝脏血清中AST、ALT指标，降低肝损伤的肝脏血清中TNF含量、肝脏指数和MDA含量，具有很好的肝保护作用。 本发明还提供了野菊花有效部位的两种应用，其一为野菊花有效部位在制备抗乙肝病毒药物中的应用，其二为野菊花有效部位在制备肝保护组合物中的应用。本发明的野菊花有效部位可以作为活性成分，制备成具有抗乙肝病毒的药物，或者具有护肝作用的组合物，如食品、饮料、保健品、药物等，涉及药物的可以采用片剂、胶囊、散剂、注射剂等医学上可接受的任何剂型。至浸膏；2)取浸膏加水制成混悬液，加入萃取液进行萃取三次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯，其体积比40 :1，三次萃取后合并进行减压回收溶剂，即得到有效部位。实施例2本发明的野菊花有效部位采用如下步骤提取而成I)取野菊花，加入8倍重量的75%乙醇提取三次，合并提取液，过滤后将滤液浓缩
至浸膏；2)取浸膏加水制成混悬液，加入萃取液进行萃取三次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，其体积比30 3 :0. 5，三次萃取后合并进行减压回收溶剂，即得到有效部位。实施例3本发明的野菊花有效部位采用如下步骤提取而成I)取野菊花，加入10倍重量的60%乙醇提取三次，合并提取液，过滤后将滤液浓缩
至浸膏；2)取浸膏加水制成混悬液，加入萃取液进行萃取五次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，其体积比10 5 :1，五次萃取后合并进行减压回收溶剂，即得到有效部位。实验例(I)抗乙肝病毒作用实验方法利用H印G2. 2. 15细胞作为平台，研究了有效部位(CIC)的体外抗HBV作用。采用MTT法检测细胞毒性并计算得TC50 ;采用ELISA法检测对细胞上清液中HBsAg、HBeAg表达的影响。结果活性部位对乙肝病毒具有较为明显的抑制作用(有效低毒)，并具有量效关系。表I为9天HBsAg表达结果，表2为9天HBeAg表达结果实验结果有效性的判断及说明
TC50:表示半数致死浓度，单位yg/mlIC50:表示抑制抗原半数有效浓度,单位y g/mlTI:表示治疗指数，计算公式为TC50/IC50TKl. 0 :有毒无效I. 0彡TI彡2. 0 :低毒有效2. 0<TI<10. 0 :有效低毒TI彡10.0:高效低毒表19天HBsAg表达结果实施例丨实施例2实施例3 ^wiI—^ClC^ 浓度 CU 浓度 CIC
M g/m I 抑制书 (J g/ml 抑制率 p r/iu I 抑制率
50.0 0.960 30 0. K22 20.0 0. 82------
TC5058.31
^IC5019. 55
TI I_2^98_表29天HBeAg表达结果
实施例j实施例2 I实施例3
^H—I—cnc mi—I—cic — —mi^ cic
M g/ml 抑制率 P g/ni _制率 p g/ml 抑制率50~0 0.991 30 0.881 200 0. 710TC50 I58.31
IC5019.40
TI3. OJ(2)肝保护作用利用刀豆球蛋白A (Con - A)引起小鼠免疫性肝损伤试验，研究了有效部位(CIC部位)对肝损伤的保肝降酶作用。研究表明有效部位部位对肝脏血清中的ALT、AST、IFN、TNF、肝脏指数、肝组织MDA的影响不同，病理切片表明有效部位能较好地帮助肝损伤恢复。结果见表3、4、5、6。
有效部位配制称取实施例I 3提取的有效部位适量，用丙二醇和1%羧甲基纤维素钠溶解。有效部位组剂量范围5 45%，具体的实施例I为5%，实施例2为25%，实施例3为 45%。模型建立方法实验动物模型采用Balb/c小鼠iv. ConA造免疫性肝损伤模型,检测小鼠血清中AST、ALT水平，细胞因子IFN- y ,TNF- a以及肝组织中的MDA含量，检测指标均明显升高，观察肝脏病理切片，肝细胞有空泡变性和坏死，呈弥散性分布，有炎性细胞浸润，且细胞排列紊乱，造模成功。 试验方法小鼠灌胃给药，连续7天，首日上下午和次日下午各给药I次，其余均每天一次。末次给药后，禁食不禁水4h，每只小鼠以20mg/kg剂量尾静脉注射ConA (空白组注射PBS)，禁食不禁水12h，以造免疫性肝损伤模型。
小鼠摘眼球采血，分离血清待测，保存于_20°C冰箱。小鼠脱颈处死，立即解剖，取肝脏称重，选取病变部位，于4%甲醛中固定，制备肝组织切片，剩余部分保存于_20°C冰箱，用于肝组织MDA含量检测。各生化指标检测均按试剂盒使用说明进行，肝组织制作病理切片观察。表3不同药物剂量对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响


本发明公开了一种野菊花有效部位，采用如下步骤的方法提取而成1)取野菊花，加入5～10倍重量的60～90%乙醇提取，提取液过滤后将滤液浓缩至浸膏；2)将浸膏加水制成混悬液，加入萃取液进行萃取，回收萃取液得到野菊花有效部位。本发明通过实验证实了本发明的野菊花有效部位，可以对乙肝病毒具有较为明显的抑制作用，也可以抑制肝损伤的肝脏血清中AST、ALT指标，降低肝损伤的肝脏血清中TNF含量、肝脏指数和MDA含量，具有很好的护肝作用。本发明的野菊花有效部位可以作为活性成分，制备成具有抗乙肝病毒的药物，或者具有护肝作用的组合物，如食品、饮料、保健品、药物等，涉及药物的可以采用片剂、胶囊、散剂、注射剂等医学上可接受的任何剂型。