专利名称：源自巴西橡胶树的乳胶分泌组织特异性srpp启动子及其用途的制作方法通常被称为橡胶树(rubber tree)的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)属于大戟科(family Euphorbiaceae),是在橡胶树属中经济层面上最为重要的一种树。巴西橡胶树可大量生产作为天然橡胶主要原料的乳胶(latex)，几乎是目前工业上唯一已知的天然橡胶资源。90%以上的天然橡胶由马来西亚、印度尼西亚、泰国及緬甸等东南亚地区生产，而韩国每年使用的20万吨以上的天然橡胶全部都是依靠进口获得。橡胶树中橡胶的生物合成在橡胶树产乳菌丝(lactifer)细胞质的乳胶中浮游的橡胶粒子(rubber particle)表面产生。已知上述橡胶粒子结合有几个橡胶粒子结合蛋白质(RPP,rubber particle-associated protein),其中 SRPP 是与直径在 10 μ m 以下的小橡胶粒子结合的蛋白质。但是关于SRPP是否只在乳胶组织中表达这一问题，还处于还没有经过组织解剖学方法进行精密验证的状态。蛋白质的合成始于DNA编码的遗传信息传递到mRNA的转录(transcription)过程。上述转录通过位于基因上游(upstream)的启动子与RNA聚合酶(polymerase)的结合而开始。所有的启动子在离转录起始点一定距离的位置上具有共有碱基序列(consensussequence),已知其对于RNA聚合酶的启动子的识别和结合来说非常重要。这些启动子是决定重组蛋白质产生效率的重要因素之一。现有的源自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子是在双子叶植物的所有组织中表达效率极佳的启动子。因此，是在植物体中表达基因方面最能够有效使用的启动子。但是，上述启动子不适合使特定基因转化而仅在所需要的组织表达时使用。因此非常需要研究开发出一种组织特异性表达启动子，其能够减少需要的组织外的其它组织中的不必要的表达。本发明人制备了对于SRPP重组蛋白质的抗体，并实施免疫染色分析法，其目的在于，确认源自巴西橡胶树的SRPP基因是否在乳胶分泌组织中特异性表达。韩国授权专利第10-0789274号公开有一种源自谷氨酸棒状杆菌的新型启动子，韩国授权专利第10-078 1059号公开有一种转化植物体的制备方法，该方法利用源自拟南芥的环境应激诱导性启动子，使靶蛋白质在保卫细胞中进行特异性表达。发明内容本发明要解决的技术问题本发明是为了实现上述目的而完成的。本发明人通过组织解剖学方法确认了源自巴西橡胶树的SRPP、蛋白质仅在乳胶分泌组织中特异性表达，对SRPP启动子碱基序列进行研究后，制备了在SRPP启动子上结合标记(Marker)基因(GUS)的转化载体CpBI 101-SRPPpro::⑶S)，将其转化到具有乳胶分泌组织、且容易转化的模型植物体-俄罗斯蒲公英上，确认了依靠SRPP启动子的⑶S表达是否在乳胶分泌组织中特异性的被诱导，从而完成了本发明。
技术方案
为了解决上述课题，本发明提供源自巴西橡胶树的SRPP启动子，其由SEQ ID N0.1的碱基序列构成。
此外，本发明提供包含上述启动子的重组植物表达载体。
此外，本发明提供转化上述重组植物表达载体的植物体及其种子。
此外，本发明提供使外源基因在转化植物体内乳胶分泌组织特异性表达的方法，该方法包括在上述重组植物表达载体上重组外源基因的步骤。
此外，本发明提供由上述方法制备的外源基因在乳胶分泌组织特异性表达的转化植物体及其种子。
有益效果
利用本发明的源自巴西橡胶树的SRPP启动子，可获得使外源基因在乳胶分泌组织中特异性表达的转化植物体，因此有望在植物体内调节天然橡胶生物合成过程和生产率的增减。


图1示出了利用免疫组织解剖学分析对巴西橡胶树叶柄中SRPP蛋白质的表达位置进行确定的结果。
图2为从巴西橡胶树叶中提取的基因组DNA中分离SRPP启动子的过程的模式图。
图3示出了用于启动子-GUS分析制备的转化载体的模式图。将分离的SRPP启动子插入至Hind III和X mal之间，从而制备了重组载体(pBIlOl-SRPPpromotor::⑶S(pBI 101-SRPP启动子::⑶S))，以诱导GUS基因的表达。
图4为表示将pBI 101-SRPP启动子:AUS载体转化至具有乳胶分泌组织的俄罗斯蒲公英的过程的照片。(A)表示在叶子切片愈伤组织(Callus)中转化的新生芽从卡那霉素(Kanamycin)选择培养基 中长出，(B)将转化的俄罗斯蒲公英转至土壤培养基后培养2_3个月。(C)提取基因组(Genomic) DNA初次验证转化，(D)提取总(Total) RNA后根据NPT II(卡那霉素)基因的表达情况，筛选出5个最终转化的俄罗斯蒲公英品系(lines)。
图5示出了与非转化俄罗斯蒲公英(野生型(Wild Type))的根组织中未检测出⑶S基因的表达相比(左侧)，在SRPP启动子:AUS转化俄罗斯蒲公英根部检测出⑶S基因表达的RT-PCR结果(右侧)。TkGAPDH表示看家基因(house-ke印ing gene)。在乳胶分泌组织极少的叶子组织中，在俄罗斯蒲公英SRPP启动子::GUS转化体的叶子中几乎未检测出⑶S基因的表达。这些结果表明SRPP启动子在乳胶组织中特异性表达⑶S基因。图6为表示俄罗斯蒲公英SRPP启动子:AUS转化体的根部发生⑶S染色的照片(右侧)。与之相比，非转化俄罗斯蒲公英(野生型)的根部组织中则未发现蓝色⑶S染色(左侧)。图7为为了进一步调查根部的GUS染色是否具有乳胶分泌组织特异性，在显微镜下对切断的根部横截面进行拍摄并的照片。野生型俄罗斯蒲公英根部组织的横截面中未见蓝色⑶S染色(A)，与此相反，SRPP启动子::GUS转化的俄罗斯蒲公英根部组织的横截面中的⑶S染色则显示出了乳胶组织特异性(B)。在其旁边附加了将四角形内的部分扩大的照片。图8示出了在乳胶分泌组织中生成的乳胶分泌液中对⑶S染色进行调查的结果，俄罗斯蒲公英SRPP启动子::GUS转化体中显示出了蓝色GUS染色(右侧)。与之相比，非转化俄罗斯蒲公英(野生型)的乳胶分泌液中未见⑶S染色(左侧)。这些结果均证明了 SRPP启动子在乳胶分泌组织较多的部位，特别是根部乳胶分泌组织中，更准确地说是在乳胶分泌液中表达。

术语“重组”是指复制异种核酸或表达上述核酸或表达由肽、异种肽或者异种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能将在上述细胞的天然形态中不被发现的基因或者基因片段表达为正义引物或者反义引物形态中的一个。另外，重组细胞可表达从天然状态的细胞中发现的基因，但上述基因是发生变形的，是通过人为手段再导入至细胞内的基因。
术语“载体”在表示向细胞内传递的DNA片段、核酸分子时使用。载体能够复制DNA，并在宿主细胞中单独再生产。术语“传递体”通常与“载体”互换使用。术语“表达载体”是指包括适当的核酸序列的重组DNA分子。所述适当的核酸序列为表达目标编码序列、以及表达特定宿主生物中可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列。在真核细胞中可利用已知的启动子、增强子、结束信号及聚腺苷酸化。
植物表达载体的优选例有根癌土壤杆菌等，其为在适当的宿主中存在时，可将自身的一部分，即所谓的T-区域转移至植物细胞的T1-质粒载体。其它类型的T1-质粒载体(参见EP0116718B1号)作 为能够将目前的植物细胞，或者杂合DNA适当地转移至植物基因组内的，能够生产出新型植物的原生质体，用于转移杂合DNA序列。T1-质粒载体的最优选的形态是EP0120516B1号及美国专利第4，940, 838号中要求保护的所谓双元(binary)载体。本发明中的可用于将基因导入植物宿主中的其它适合的载体可以选自源于双链植物病毒(比如,CaMV)及单链病毒、双粒病毒(Gemini virus)等的病毒载体，例如可以选自非完整性植物病毒载体。这些载体特别有利于难以适当地转化植物宿主时使用。
表达载体优选包含一个以上的选择性标记。上述标记通常是具有可用化学方法被选择的特性的核酸序列，即包括能将转化细胞从非转化细胞中区分出来的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或者草胺膦等抗除草剂抗性基因，卡那霉素、G418、博莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因，但不局限于此。
本发明中的重组载体可使用通常的终止子，例如有胭脂碱合酶(N0S)、水稻α -淀粉酶、RAmylA终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌土壤杆菌的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等，但并不局限于此。对于终止子的必要性，一般被认为是这些区域能促进植物细胞内转录的确定性及效率。因此，在本发明的内容中使用终止子是非常适合的。
并且，本发明提供转化上述重组植物表达载体的植物体及其种子。
植物的转化是指能将DNA转移至植物的任意方法。这些转化方法不一定需要经过再生及(或)组织培养期。目前，植物种的转化不仅对于双子叶植物，包括单子叶植物量子的植物种也非常普遍。原则上，任意的转化方法均可被用于将依据本发明的杂合DNA导入到祖细胞中。所述方法可选自对于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens, F.A.et a1., 1982, Nature296,72-74;Negrutiu 1.et al., Junel987,Plant Mol.Biol.8, 363-373(Krens, F.A.等人.，1982，自然 296，72-74; Negrutiu 1.等人.，1987 年 6 月，植物分子生物学8，363-373))、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.et al., 1985Bio/Technol.3，1099-1102 (Shillito R.D.等人.，1985 生物 / 技术 3，1099-1102))、作为植物元素的显微注射法(Crossway A.et al.，1986, Mol.Gen.Genet.202，179-185 (克洛斯威A.等人.，1986，分子遗传学和基因组202，179-185))、各种植物元素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轰击法(Klein T.M.et al., 1987, Nature327, 70 (Klein T.M.等人.，1987，自然327，70))、依据植物的浸润或者成熟花粉或者小孢子转化的，根癌土壤杆菌介导的基因转移(非完整性)中依据病毒的感染(EP0301316号)等。本发明的优选方法包含土壤杆菌介导的DNA转移。更为优选的是利用EP A120516号及美国专利第4，940，838号所记载的所谓双元载体技术的方法。用于植物转化的“植物细胞”可为任意的植物细胞。植物细胞可以是培养细胞、培养组织、培养器官或者整个植物，优选培养细胞、培养组织或者培养器官，更为优选培养细胞的任意形态。“植物组织”是分化或者未分化的植物组织，例如包含果实、茎、叶子、花粉、种子、癌组织及用于培养的各种形态的细胞，即单细胞、原生质体(protoplast)，芽及愈伤组织，但不局限于此。植物组织可为植物(in planta)或器官培养、组织培养或者细胞培养状态。此外，本发明还提供使外源基因在转化植物体内乳胶分泌组织特异性表达的方法，该方法包括以下步骤:在所述重组植物表达载体上重组外源基因；以及将所述重组植物表达载体转化到植物体。上述外源基因可以编码选自橡胶聚合酶、橡胶生物合成相关酶类、白细胞介素、干扰素、血小板衍生生长因子、血红蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白、胰岛素、成纤维细胞生长因子、人生长因子、人血清白蛋白及红细胞生成素的蛋白质，但不局限于此。所述外源基因可以是希望在植物体内乳胶分泌组织中表达的任意基因，其位于本发明的乳胶分泌组织特异性表达载体中的上述启动子后面，并可根据需要与报告基因融合表达。将上述重组的乳胶分泌组织特异性表达载体转化到植物体的方法可根据前面所述的方法实施。并且，本发明提供由上述方法制备的外源基因在乳胶分泌组织特异性表达的转化植物体及其种子。所述植物体优选双子叶植物，但不局限于此。双子叶植 物可为岩梅科(裂缘花科，Diapensiaceae)、棺叶树科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜醇花科(Ericaceae)、紫金牛科(Myrsinaceae)、报春花科(Primulaceae)、蓝雪科(Plumbagi naceae)、柿树科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、山帆科、灰木科(Symplocaceae)、木庫科(木庫，Oleaceae)、马钱科(Loga niaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、夹竹桃科(亚洲络石，Apocynaceae)> 萝摩科(Asclepiadaceae)、菌草科(R ubiaceae)、花葱科(Polemoniaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、唇形科(Labiatae)、爺科(Solanaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、紫蔵科(Bignoniac eae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列当科(Orob anchaceae)、苦苣笞科(Gesneriaceae)、涯藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前草科(Plantaginaceae)、忍冬科(Capr ifoliaceae)、五福花科(Adoxaceae)、败醫科(Valerianaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、結梗科(Campanulaceae)、菊科(Compositae)、杨梅科(Myricaceae )、胡桃科(Juglandaceae)、杨柳科(Salicaceae)、禅木科(Betulaceae)、山毛棒科(壳斗科，Fagaceae)、偷科(Ulmac eae)、桑科(Moraceae)、尊麻科(Urticaceae)、植香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、寥科(寥，Polygonaceae)、商陆科(商陆，PhytoIaccaceae)Λ紫荣莉科(Nyctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、马齿觅科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、黎科(Cheno podiaceae)、觅科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、八角科(Illiciaceae)、棒科(Lauraceae)、连香树科(Cercidiphyllaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、小梁科(Berberid aceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科( 藤，Menispermaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、金鱼藻科(CeratophylIaceae)、药菜科(C abombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟兰科(Chloranthaceae)、马览铃科(Aristolochiaceae)、称猴桃科(A ctinidiaceae)、荼科(山荼科，Theaceae)、藤黄科(Guttiferae)、茅膏菜科(Droseraceae)、S 粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparida ceae)、十字花科(十字花，Cruciferae)、洋桐木科(悬铃木科，Plat anaceae)、金镂梅科(金镂梅，HamameI idaceae)、景天科(景天，C rassulaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)λ 海桐花科(Pittosporaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、显科(Leguminosae)、酔衆草料(Oxalidaceae)、牛儿苗科(Geraniaceae)、旱金莲科(T ropaeolaceae)、瘈藜科(Zygophyllaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水马齿科(Callitrichaceae)、芸香料(Rutaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、棟科(Meliaceae)、远志科(Polygalaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、械树科(枫树科，Aceraceae)、无患子科(S apindaceae)、七叶树科(hippocastabaceae)、清风藤科(Sabiaceae)、凤仙花科(水凤仙，Balsaminaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、卫矛科(卫茅科，Celastraceae)、旌节花科(Staphyleaceae)、黄杨科(Bu xaceae)、岩高兰科(Empetraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae )、杜英科(Elaeocarpaceae)、锻树科(Ti I iaceae)、锦奏科(Malvaceae)，梧桐科(Sterculiaceae)，瑞香科(瑞喷鼻科，Thymel aeaceae)、胡颜子科(Elaeagnaceae)、大风子科(Flacourtiaceae)、堇菜科(Violaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、径柳科(Tamaricacea e)、沟繁缕科(Elatinaceae)、海棠科(Begoniaceae)、葫芦科(Cucu rbitaceae)、千屈菜科(千屈菜，Lythraceae)、石植科(Punicaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、小二仙草科(Haloragaceae)、八角枫科(A Iangiaceae)、山茱萸科(四照花科，Cornaceae)、五煎科(五科加，A raliaceae)或者伞形科(伞形花科)(Umbelliferae(Apiaceae))，但不局限于此。
以下，通过实 施例详细说明本发明。但下述实施例仅用于例示本发明，因此本发明的内容不会被下述实施例所限定。
实施例1:制备对于SRPP蛋白质的抗体
为了验证SRPP基因是否在乳胶分泌(laticiferous)组织中特异性表达，制备了对于SRPP重组蛋白质(大肠杆菌表达)的抗体。
实施例2:在巴西橡胶树的叶柄横截面上对于SRPP蛋白质的组织解剖学免疫染色分析
用于免疫化学分析的组织固定及包埋
组织块是利用布莱泽(blazer)由叶柄制备而成，为防止乳液的流出，迅速浸没在固定缓冲液(溶解于PBS制备的4% (v/v)多聚甲醒(paraformaldehyde))中。固定一晚后，用PBS清洗上述组织块。然后将上述组织块立即包埋于化合物(冰冻切片用包埋组织剂(Tiss ue-Tek OCT) ; Sakura Finetechnical公司，东京，日本)中，在液氮中冷冻。之后再制备成厚度为40 μ m的切片，于_2(TC条件下在低温恒温器(cryostat) (CM-1850;莱卡公司(Leica Microsystems))中保存。
免疫化学组织解剖分析下述所有步骤均在室温条件下进行。利用PBS去除OCT化合物后，切片在包含10%马血清(胎牛血清，奥克兰，新西兰)的PBS中封闭20分钟。之后，将以10μ g/mL的浓度稀释到新的PBS溶液中的50 μ I各个小鼠的I次抗体添加至上述切片中孵育6小时，上述PBS中包含10%马血清及0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，上述切片用PBS清洗3次，每次10分钟。再将通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)共轭的2次抗体50 μ I添加至上述切片中孵育4小时。所述碱性磷酸酶通过以下方法制得。将碱性磷酸酶以10 μ g/mL的浓度稀释到包含10%马血清及0.1%聚乙二醇辛基苯基醚的新PBS中，从而制得。将上述切片再次用PBS清洗3次,每次10分钟,添加磷酸酶的底物p-硝基酹(p-nitrophenol)使其显色。(Planta Vol.230，Numberl, 215-225，DO1:10.1007/s00425-009_0936-0 (植物，第 230 卷，I 号，215-225，DO1: 10.1007/s00425-009-0936-0))。其结果，可确定SRPP蛋白质仅在乳胶分泌组织中特异性表达(图1)。实施例3:从巴西橡胶树叶子中分离SRPP基因启动子采用通常的方法从巴西橡胶树叶子中提取基因组DNA，提取的基因组DNA用Taq I进行处理，使其断成多个片段，后将切断的基因组DNA用连接酶处理，使其发生自体连接。之后，从SRPP5’ -UTR (非翻译区)的Taq I部分向两侧方向制备引物后实施了 PCR(5，-TGGTCCATTAAAACCTGGTGTCGA-3’ (SEQ ID N0.2)及 5，_GATATGTCCTGGCATAAAGGTAGA_3’(SEQ ID N0.3))。之后对PCR分离的启动子区域进行测序(图2)。

实施例4:制备SRPP启动子与⑶S基因结合的转化载体在ρΒΙΙΟΙ载体的Hind III / X mal中插入SRPP启动子，从而制备重组载体(pBI 101-SRPP启动子::⑶S)(图3)，使其能诱导标记基因⑶S的表达。实施例5:乳胶分泌模型植物体(俄罗斯蒲公英)的转化分离SRPP启动子的巴西橡胶树不仅很难进行转化，并且由于它是桥木树，故结果需要数年的时间，因此选用了比较容易转化，且生长时间短的乳胶分泌模型植物俄罗斯蒲公英进行转化。将pBI 101-SRPP启动子::⑶S载体导入到农杆菌属菌株(Agrobacteriumstrain) GV3101中，俄罗斯蒲公英的转化是采用Bae等人(2005，Plant Cell, Tissue andOrgan Culture80:51-57(2005，植物细胞，组织和器官培养80:51-57))所记载的方法实施。从选择培养基中筛选出SRPP启动子::GUS转化体后，使其在土壤基质中生长2-3个月(图4A，B)。提取基因组DNA及总RNA，用PCR/RT-PCR分析法再次验证转化与否(图4C，D)。实施例6:转化俄罗斯蒲公英中⑶S基因的组织特异性表达作为标记基因的⑶S的表达在含有较多SRPP启动子:AUS转化体的乳胶分泌组织较多的根部非常明显，与此相比，几乎不含有乳胶分泌组织的叶子中发现表达(图5，右侧)。而非转化体野生俄罗斯蒲公英中的任何组织中均未检测出⑶S基因的表达(图5，左侧)。实施例7:转化俄罗斯蒲公英中⑶S蛋白质的组织特异性表达为了找出⑶S蛋白质表达的组织，将组织切片浸没在底物溶液中进行⑶S染色(蓝色)。组织学⑶S (β_葡萄糖醛酸酶)_染色是根据以前记载的方法进行的(Jefferson etal.Biol.Rep.5:387-405 (Jefferson 等人.生物学报告 5:387-405))。如图 6 所示，蓝色GUS染色在SRPP启动子::GUS转化体根部组织中非常明显，但在非转化体野生俄罗斯蒲公英的根部组织则未观察到。
为了更精密地检测SRPP启动子::GUS转化俄罗斯蒲公英根部的GUS染色是否为组织特异性，截断根部的横截面并在显微镜下进行观察。在野生型俄罗斯蒲公英根部组织的横截面中未观察到GUS染色(图7，左侧)，而在SRPP启动子::GUS转化蒲公英的根部横截面中，只在乳胶组织中观察到蓝色⑶S染色(图7，右侧)。
检测根部乳胶分泌组织生成的乳胶分泌液中的⑶S染色的结果显示，SRPP启动子::GUS转化俄罗斯蒲公英根部乳胶组织中分泌的乳胶分泌液中观察到蓝色⑶S染色(图8，右侧)。而与此相反，在非转化俄罗斯蒲公英(野生型)根部的乳胶分泌液中未观察到GUS染色(图8，左侧)。


本发明涉及一种源自巴西橡胶树的SRPP启动子，其由SEQ ID No.1的碱基序列构成；包含上述启动子的重组植物表达载体；转化上述重组植物表达载体的植物体及其种子；使外源基因在转化植物体内乳胶分泌组织特异性表达的方法，该方法包括在上述重组植物表达载体上重组外源基因的步骤；以及由上述方法制备的外源基因在乳胶分泌组织特异性表达的转化植物体及其种子。