专利名称：通过再生牙齿单元的移植来复原牙槽骨的方法牙齿由存在于牙齿周围的牙周组织支撑。作为一种器官，牙齿本身最外层为珐琅质，内层则具有称为牙本质的硬组织，进而于其内侧有产生牙本质的成牙质细胞，中心部为牙髓。另一方面，牙周组织具有牙槽骨骨骼作为基座，在连接牙槽骨与牙根的部分，牙根的周围有珐琅质以及牙周膜，以覆盖牙槽骨的除与牙根相连部分以外的外层而形成牙龈。发生于牙周组织的疾病有牙龈因发炎而产生的牙龈炎，发炎深至牙周组织而产生的牙周炎，进而发展至牙槽骨溶解而减少的牙槽脓溢(pyorrhea alveolaris)等。牙槽骨不幸溶解时即难以支持牙齿，进而丧失牙齿。另外，因经年持续的牙槽骨吸收，亦会变为难以支持牙齿。 另一方面,在牙齿本身患有疾病而失去牙齿时,常会进行移植物治疗。此时为移植移植物，必须有可支持移植物的牙槽骨，而当牙槽骨不足时，无法进行移植物治疗。另外，即使进行移植物治疗时仍具有充分的骨组织，但已知在移植物移植后，牙槽骨的吸收仍持续进行。因此，目前对复原或再生已丧失的牙槽骨的技术已逐渐产生兴趣。近年来使用GTR法(guidedtissue regeneration :引导组织再生)及Emdogain (注册商标)治疗牙周病。GTR法是在进行牙周外科手术后，通过插入间隔膜，防止对牙龈上皮的牙槽骨侧的侵入，可促进牙周膜及牙槽骨等牙周组织垂直再生的方法。而Emdogain (注册商标)是以牙釉基质蛋白质为主成分的药剂，是使被破坏的牙周组织再生的方法。然而，任一种方法均难以促进牙槽骨垂直地再生，特别对于大型牙槽骨再生，其效果并不充分。本发明人着眼于牙齿再生并发现，通过使用至今已知的间叶系细胞与上皮系细胞(其中，这些细胞中至少一种是衍生自牙胚的细胞)，在由例如胶原蛋白凝胶等所构成的支持载体内部，使实质上由间叶系细胞构成的第一细胞凝集块，与实质上由上皮细胞构成的第二细胞凝集块紧密接触而配置，然后通过在该支持载体内部培养第一及第二细胞凝集块，可制得可有效诱导细胞分化且具备特有的细胞配置及方向性的再生牙胚及再生牙齿单元(例如参照专利文件I)。进而，利用口腔内上皮细胞及其初代培养细胞做为上皮系细胞时(例如参照专利文件2)，利用羊膜衍生细胞作为间叶系细胞时(例如参照专利文件3)，将全能干细胞经分化诱导后的细胞用作间叶系细胞时(例如参照专利文件4)，均显示可获得同样具备特有的细胞配置及方向性的再生牙胚及再生牙齿单元。该再生牙齿在咬合及硬度等方面已显示可与天生的牙齿同样使用(例如参照专利文件5)。[在先技术文献][专利文件]专利文件I :国际公开第2006/129672号公报专利文件2 :特开2008-29756号公报专利文件3 :特开2008-206500号公报专利文件4 :特开2008-200033号公报专利文件5 :国际公开第2010/021340号公报
本发明要解决的问题本发明的目的在于复原牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨。 解决问题的手段本发明人为解决上述问题反复研究，结果发现对于牙齿缺损的哺乳动物的牙齿缺损部位，通过移植再生牙齿单元，相较于移植再生牙齿单元前，可使牙槽骨复原。亦即，本发明涉及一种用于对牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨进行复原的方法(牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨复原方法)，其包括将再生牙齿单元移植至该牙齿缺损的部位的步骤。在本发明的对牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨进行复原的方法的一个实施方式中，该动物为非人类的哺乳动物。 本发明的对牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨进行复原的方法的一个实施方式中，其包括下述步骤(a)制作再生牙胚的步骤，(b)将该再生牙胚置于哺乳动物的活体内进行培养，以制作再生牙齿单元的步骤，(C)将所述再生牙齿单元移植至哺乳动物的牙齿缺损部位的步骤。本发明的牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨复原方法的一个实施方式，其包括下述步骤(a)制作再生牙胚的步骤，(b)将所述再生牙胚置于哺乳动物的活体内进行培养，以制作再生牙齿单元的步骤，所述哺乳动物是与颚骨复原对象不同的个体，(C)将该再生牙齿单元移植至作为颚骨复原对象的哺乳动物的牙齿缺损部位的步骤。本发明的牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨复原方法的一个实施方式中，通过将实质上由间叶系细胞构成的第一细胞集合体与实质上由上皮细胞构成的第二细胞集合体以紧密接触的方式配置在支持载体内部而对该再生牙胚进行培养和维持，且间叶系细胞与上皮细胞中至少一方来自牙胚。本发明的牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨复原方法的一个实施方式中，所述(b)步骤是对配置于哺乳动物活体内的间隔构件内部的再生牙胚进行培养。本发明的牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨复原方法的一个实施方式中，所述(b)步骤中，从哺乳动物外部施加机械性的刺激。另外，根据本发明另一实施方式，本发明也涉及用于上述牙槽骨复原方法的牙槽骨复原用再生牙齿单元。根据本发明另一实施方式，本发明也涉及上述牙槽骨复原方法中使用的再生牙齿单元制作用再生牙胚。发明效果根据本发明，可通过移植再生牙齿单元，复原哺乳动物的牙槽骨。特别本发明中的一个实施方式涉及先前技术难以实现的牙槽骨在垂直方向的复原。作为本发明的一个实施方式，根据移植使用间隔构件所制作的再生牙齿单元的方法，即使于动物的活体内培养再生牙胚，亦可在不会受到来自该动物的组织等过多压力的情况下获得再生牙齿周边的牙周组织广为发育的再生牙齿单元，而通过移植该再生牙齿单元，可使被移植的动物的牙槽骨更好地复原。另外，作为本发明的一个实施方式，根据移植使用间隔构件所制作的再生牙齿单元的方法，可在预防牙齿伸长至所需程度以上的同时，促进牙周组织发育而长时间培养，且通过移植该再生牙齿单元，可使被移植的动物的牙槽骨更好地复原。作为本发明的一个实施方式，通过调整间隔构件的大小及形状为适合牙齿缺损部位的大小及形状，通过移植使用该间隔构件所培养制作的再生牙齿单元，可使再生 牙齿单元移植更容易成功，且使被移植的动物的牙槽骨更好地复原。进一步地，作为本发明的一个实施方式，根据移植由施加机械性的刺激所制作的再生牙齿单元的方法，即使在动物的活体内培养再生牙胚时，也可获得具有充分牙周组织的再生牙齿，通过移植该再生牙齿单元，可使被移植的动物的牙槽骨更好地复原。

图I是显示本发明的一个实施方式中在使用间隔构件制造再生牙齿单元时，在配置于小鼠肾被膜下的间隔构件内进行活体内培养的再生牙胚的外观的照片。图2是使用间隔构件制作的再生牙齿单元的显微CT图像。图3是未使用间隔构件制作的再生牙齿单元的显微CT图像。图4是表示于CT图像上测定及计算使用间隔构件制作的再生牙齿单元(控制)、未使用间隔构件制作的再生牙齿单元(非控制)、及天然牙齿的齿冠部的长径/短径比的结果O图5是表示于CT图像上测定使用间隔构件制作的再生牙齿单元(控制)及未使用间隔构件制作的再生牙齿单元(非控制)的长度的结果。图6是在活体内培养再生牙胚期间施加机械性刺激而制作的再生牙齿单元与未施加刺激而制作的再生牙齿单元的HE染色照片。图7是于CT图像上测定在活体内培养再生牙胚期间施加机械性刺激而制作的再生牙齿单元，与未施加刺激而制作的再生牙齿单元的牙周膜的宽度的结果。图8是显示将根据本发明方法制造的再生牙齿单元移植至颚骨的情形。图9是显示将根据本发明方法制造的再生牙齿单元移植至颚骨后O天、第14天、第30天的CT图像。图10是显示将根据本发明方法制造的再生牙齿单元移植至颚骨后第30天的HE染色照片。图11是示意性表示再生牙胚配置于间隔构件内的状态的平面图及侧视图。图12是向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元的(a)立体图像、(b)CT图像、(C)CT剖面图像。
图13上排是未向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元的情况，下排是已向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元的情况，自左方依序为移植后第O天、第14天、第30天及经过40天后缺损部位(移植部位)周边的情形。图14是缺损部位(移植部位)周边于移植45天后的照片，其中左侧为对照组，SP未向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元之情况，右侧为移植例，即已向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元的情形。照片中虚线是表示移植时牙槽骨上端部的线，实线是表示移植45天后牙槽骨上端部的线。图15是表示移植后于45天间再生牙槽骨量的图示。左侧为对照组，亦即未向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元之情况，右侧为移植例，亦即已向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元时，再生的牙槽骨的骨量。图16上排是对照组，亦即未向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元之情况，下排是移植例，亦即已向大型骨缺损模型移植再生牙齿单元时，缺损部位(移植部位)周边之CT外观图像。左侧图像为移植O天后、中央为移植49天后。右侧的图是移植49天后的CT图 像的放大图，上排及下排均以虚线表示移植例的在移植49天后通过缺损部位(移植部位)牙槽骨上方的水平线。右侧上排图中将对照组缺损部位牙槽骨的上端部，与移植例的牙槽骨的上端部之垂直方向的差异以示意性的两个箭头表示。

调制来自牙胚的间叶系细胞及上皮系细胞时，首先将自周围组织隔离的牙胚，依照形状，分离成牙胚间叶组织及牙胚上皮组织。此时为容易进行分离，亦可使用酶。酶可举出分散酶(dispase)、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等。本发明中细胞凝集块是指来自间叶组织或上皮组织的凝集细胞，可通过对将间叶组织或上皮组织分散后获得的细胞进行凝集，或对该类细胞进行初代或继代培养而获得的细胞进行凝集而调制。为了分散细胞，亦可使用分散酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。在调制细胞凝集块前为获得足够的细胞数而进行经分散细胞的初代或继代培养时，用于培养的培养基可使用一般用于培养动物细胞的培养基，例如可使用Dulbecco氏改良培养基(DMEM)等。为促进细胞增殖可添加血清，或可添加取代血清的物质例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子及转铁蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清时之浓度，可依据当时培养状态适当地加以变更，但一般可使用约10%。有关细胞培养，可适用一般的培养条件，例如于约37°C的温度下置于5% CO2浓度的培养箱内进行培养。另外亦可适当地添加链霉素等抗生素。为使细胞凝集，可例如将细胞悬浊液进行离心处理。关于间叶系细胞及上皮系细胞的细胞凝集块，为确保二者于紧密接触时有确实的细胞相互作用，优选分别使其预先处于高密度状态。高密度状态是指具有与构成组织时相同程度的密度，例如为5X107个/ml I X 109 个/ml，以 I X 108 个/ml I X 109 个/ml 为优选，2X 108 个/ml 8X108 个/ml最佳。并未特别限定使细胞凝集块处于高密度的方法，例如可将细胞通过离心处理后，使其凝集沉淀的方法而进行。离心处理因不会损及细胞活性且可简便地高密度化而优选。离心处理以给予离心力300Xg 1200Xg的旋转数为优选，500Xg IOOOXg为更优选，时间以3分钟 10分钟为优选。低于300Xg的离心处理，会有细胞密度无法充分提高的倾向，反之，较1200Xg为高的离心处理，有时会使细胞受损。通过离心分离调制高密度的细胞凝集块时，一般可使用细胞离心分离用的试管等容器，调制细胞悬浊液后再进行离心分离，留下作为沉淀物的细胞而尽可能去除上清液即可。此时，目标细胞以外的成份(例如培养液、缓冲液)优选少于或等于细胞容量，最优选未含有除目标细胞以外的成分。将该高密度的细胞集合体以后述方法于支持载体内使其紧密接触，细胞紧密的接触，可有效发挥细胞间的相互作用。
目的为培养第一及第ニ细胞集合体所使用的支持载体，优选不使细胞分散，且具备可保持细胞集合体紧密状态的保持力。紧密接触状态是指上述之高密度的间叶系细胞及上皮系细胞之细胞集合体，在间叶系细胞与上皮系细胞的接触面附近，亦維持相似程度的高密度状态。可保持紧密状态的支持载体，例如使用胶原蛋白吋，以最终浓度为2mg/ml 3mg/ml来使用，亦即根据JIS-K6503-1996所述的方法(使用12. 7mm直径的柱塞，测定下压4mm所需要的荷重)，以可形成120g 250g的凝胶强度的浓度，以提供适合使用的适当硬度。其他种类的支持载体，若为通过相同的评价方法可得相同的強度者，即可用作本发明之支持载体。另外可通过混合ー种或多种支持载体，获得具有相当于目标凝胶强度的硬度之支持载体。作为支持载体，可使用与后述在间隔构件内配置的支持载体相同者。并未特别限定将第一及第ニ细胞集合体配置于支持载体内的方法，细胞集合体为细胞凝集块时，可例如将上述通过离心所得之沉淀物，以微注射针筒等插入支持载体内而配置。细胞集合体为组织时，可使用注射针筒的针的前端等配置于支持载体内的任意位置上。本发明中，并未限制将第一及第ニ细胞集合体与支持载体以紧密接触的方式配置 的方法，例如，可将其中一种细胞集合体配置于支持载体内之后，再通过将其他的细胞集合体以压放在前述细胞集合体上方的方式配置，可使二者紧密接触。更具体而言，通过适当地变更支持载体内上述注射针筒的针的前端之位置，可将ー种细胞集合体压放在其他细胞集合体之上。且细胞集合体使用上皮系组织或间叶系组织吋，以使该组织原本于牙胚中与间叶系组织或上皮系组织接触的面，与另外的细胞集合体接触而配置为优选。另外，优选在配置后包括固化支持载体的步骤。借此可使细胞进ー步凝集，使细胞呈现更高密度状态。例如使用胶原蛋白时，可通过于培养温度下静置数分钟至数十分钟以进行固化。此时，细胞集合体内除细胞以外的成份愈少，愈可实现更高密度状态。本发明中，“在支持载体的内部培养第一及第ニ细胞集合体的步骤”，例如可以是专利文件I至4及特开2008-29757号公报所公开的步骤，该文献公开之全文均作为本说明书之參照而合并至此处。培养期可依配置于支持载体内部的细胞数、细胞集合体的状态、培养条件、动物种类等而异，本领域技术人员可适当地选择。移植至口腔内时为使其萌发为具功能性的牙齿，以至少培养I天为优选，3天以上为更优选。通过拉长培养期，可使例如牙本质及珐琅质的蓄积、齿冠的形成、以及牙根的形成，通过形成再生牙胚而推迸。为获得所期望的状态，可培养例如6天以上、30天以上、50天以上、100天以上或300天以上，亦可于培养途中，改变培养基及培养条件。在支持载体内部的培养步骤，可単独培养内含第一及第ニ细胞集合体的支持载体，亦可于其他动物细胞等的存在下进行培养。単独培养支持载体时，培养条件可使用一般用于培养动物细胞之条件。另外于培养时可添加来自哺乳动物的血清，亦可添加已知为可有效促进该细胞増殖与分化的各种细胞因子。该细胞因子可举出例如FGF、BMP等。从细胞集合体的气体交换与营养供给的角度考虑，以及从不与其他动物细胞接触及混和，且可全程于体外条件下进行的角度而言，支持载体内部的培养，以进行器官培养为优选。器官培养一般是使多孔性膜漂浮于适合动物细胞增殖的培养基上，再于该膜上装载内含第一及第ニ细胞集合体的支持载体后进行培养。此处所使用的多孔性膜以具有许多约0. 3 5 Ii m的孔为优选，例如可举出Cell Culture Inserts (商品名)及IsoporeFilters (商品名)。本发明中使用的再生牙齿单元的制造方法中，在制作再生牙胚时，可将该再生牙胚置于哺乳动物的活体内进行培养。通过于哺乳动物的活体内培养，可促进再生牙齿的分化诱导及形成牙周组织，可形成具有更适合于本发明的牙周组织的再生牙齿单元。根据本发明的方法所得的牙齿，具有内侧为牙本质，外侧为珐琅质之牙齿特有细胞配置(构造)，更优选是于正确位置上具有牙齿的前端(齿冠)与牙根的方向性的牙齿，可充分达成牙齿的功能。因此，可广泛利用为牙齿的替代物。另外，亦可用作为阐明牙齿的发育过程的研究工具。进而，通过延长培养期，除了牙齿以外，亦可使其形成支持固定牙齿于颚骨上的牙槽骨及牙周膜等牙周组织。借此可更加提高移植后的牙齿的实用性。 另外，亦可仅分离该牙周组织而加以利用。本发明使用的再生牙齿单元，可根据缺损部的大小及欲使其再生的牙齿的大小，制作调节适当大小的牙齿。例如制作再生牙胚时，使前述的间叶系细胞集合体与前述的上皮系细胞集合体接触而配置时，可使各细胞集合体形成近似的柱状，此时，通过控制该柱的轴向的接触长度，形成具有期望长度的単一方向的牙齿。例如通过使前述间叶系细胞集合体与前述上皮系细胞集合体的接触长度，为期望的再生牙齿齿冠宽度的±25%，可制作具有期望长度的再生牙齿。构成本发明使用的再生牙齿单元的牙齿，具有内侧为牙本质，外侧为珐琅质的牙齿特有细胞配置(构造)，更优选是于正确位置上具有牙齿的前端(齿冠)与牙根的方向性的牙齿，且可充分达成牙齿功能的牙齿。因此，可广泛利用为天然牙齿的替代物。进而本发明使用的再生牙齿单元，除了牙齿之外，具有将牙齿在颚骨上支持固定化的牙槽骨及牙周膜等牙周组织，借此，可进而提高移植后颚骨的复原性。本发明其他实施方式有关的颚骨的复原方法所使用的再生牙齿单元，在哺乳动物的活体内培养时，可使用间隔构件进行培养。更具体是在制作再生牙胚后，可将再生牙胚配置于间隔构件内，并将含再生牙胚的间隔构件移植至哺乳动物的活体内，进行培养。本说明书中，间隔构件是在哺乳动物的活体内培养再生牙胚时，用作防止再生牙胚的伸长超过所需程度以上，配置成覆盖再生牙胚的器具。另外，间隔构件于例如在肾被膜下等活体内培养时，可达到防止被膜的压カ及活体内的组织对再生牙胚施加过多压カ之效果。只要间隔构件的形状可达成该目的，可为任何形状。亦即，间隔构件的形状，只要可确保使具有期望的再生牙齿单元的尺寸(主要为长度及厚度)的再生牙齿单元生长的内部空间即可。再生牙齿单元的长度是指，从再生牙齿单元的牙齿部分未来为咬合面的部位，至未来为根尖的部位的长度。在未来为根尖的部位的周围形成牙周组织时，是指至其前端(距离未来为咬合面部位最远的部位)之距离。再生牙齿单元长度的近似最大允许值是指在哺乳动物的活体内培养再生牙胚后，所获得的再生牙齿单元的长度的可被允许的最大值。该近似最大允许值可根据移植再生牙胚的对象及部位，由本领域技术人员适当地加以決定。再生牙齿单元的厚度一般而言是指再生牙齿单元的齿冠部的厚度，但在未来为根尖的部位的周围形成牙周组织时，是指具有牙周组织的部分的厚度。如同人类的牙齿，齿冠部的横截面一般并非为完全的正方形或长方形，不如说是依据长径与短径而定义。由于根据以往的发现，可相当程度地控制再生牙胚的伸长方向，因此于间隔构件的内部，可将于配置再生牙胚组合物时的再生牙胚组合物本身的方向，及于间隔构件内部的相对位置，依照期望伸长的方向安排，且可任意调整。因此，为获得期望的尺寸，可考虑再生牙胚组合物伸长的方向，来设计间隔构件的三维尺寸。一般而言，间隔构件的内部空间必须比期望的再生牙齿单元大。換言之，间隔构件的内部空间，可达成防止再生牙齿单元伸长至最大允许值以上的作用。以下针对间隔构件的形状为上下开ロ的圆筒状(环状)之情况进行说明。本领域技术人员可以本说明书之公开内容为基础，而可容易地设计具有期望形状之间隔构件。形状为上下开ロ的圆筒状(环状)时，由于上下的开ロ部互通，可充分确保来自间隔构件外部的营养供给通路，而使得能够形成再生牙齿单元。 另外，使用该圆筒状(环状)的间隔构件时，使再生牙胚的伸长方向为圆筒环的横向(亦即为圆筒的径向)时，可将圆筒的纵向(亦即为圆筒的高度)，以可获得期望的再生牙齿单元咬合面的厚度而设定，且不超过最大允许值。另外，可将圆筒的纵向(亦即为圆筒的高度)，以可获得期望的再生牙齿单元牙周组织的厚度而设定，且不超过最大允许值。此时所期望的厚度及最大允许值，可根据对象动物牙齿缺损部的大小及形状而決定。再生牙齿单元的牙周组织形状以形成为匹配作为移植对象的缺损部的大小及形状，移植易成功，且容易实现骨整合而为优选。为防止再生牙齿单元伸长至所需程度以上的长度，可将圆环的内径设定为期望的再生牙齿单元长度的近似最大允许值。使用该圆筒状的间隔构件吋，以环的内径方向作为伸长方向，以纵向(高度方向)作为再生牙齿单元的齿冠宽度而配置再生牙胚时，筒的高度于培养人类牙齿时以例如3-15mm为优选，5-12mm为更优选，培养小鼠牙齿时以例如0. 4-2. Omm为优选，0. 6-1. 8mm为更优选，其内径(内直径)于培养人类牙齿时以10-30mm为优选，15-26mm为更优选，培养小鼠牙齿时以0. 9-2. Omm为优选，I. 2-1. 9mm为更优选。进而利用近似圆筒状的间隔构件时，将再生牙胚未来为咬合面之部位配置至间隔构件的一面内壁附近而面向此内壁，且将未来为根尖的部位配置为朝向筒的内径方向，再生牙胚不会受到来自活体内组织的过多压力，且可防止再生牙胚伸长至需要以上，并可与外部连通可确保物质供给路径。再生牙胚的咬合面不会因压カ而损坏，可以自然形状生长，牙齿会往筒的直径方向伸长，一般在到达相对侧壁之前，或到达后，可以未达最大允许值的长度阻止其伸长。再生牙胚可通过间隔构件避免来自筒的水平方向的压力，同时，可藉由间隔构件的上端及下端免除大部分的来自上下方向的压カ。本领域技术人员应可不限于圆筒状，达成本说明书期望的目的，或可依据需求达成其他目的，在活体内制造再生牙齿单元时，可使用具有任意的期望的形状的间隔构件。例如可举出以底面为椭圆或多角形的对象，或球状物来取代圆筒，但并未限定于此。本发明之间隔构件的构造使得，在内部配置的再生牙胚可与间隔构件外部连通。由于再生牙胚可接受来自哺乳动物活体内组织之营养等供给，及受到动物细胞产生的细胞激素的作用，必须确保该物质到达间隔构件的再生牙胚之供给路径。由于可与外部连通，不管间隔构件的形状、大小、个数如何，均可形成足够物质供给的孔。例如，具有如筒状的部分的大孔为优选，另外对间隔构件整体而言，以具有如筛网般多数的小孔为优选。另外，间隔构件的材质若可供物质穿透，则有孔无孔均可。本发明使用的再生牙齿单元，在使用间隔构件制造再生牙齿单元时，培养再生牙胚时所用之哺乳动物，只要能够在活体内培养再生牙胚，则无特别限定，亦可为非哺乳动物。例如牛、马、猪、犬、猫、小鼠，以猪、小鼠为优选。特别优选是与牙胚组织相同种类的动物。移植至与牙胚组织不同种的动物进行培养时，以使用改造为免疫缺陷的动物为优选。适合活体内育成的部位，为使动物细胞的器官及组织尽可能的正常发育，以肾被膜下、肠系膜、皮下等为优选。移植后的培养期依移植时牙齿的大小与要发育的牙齿的大小而异，一般可为3天 400天。例如移植至肾被膜下吋，虽依移植时牙胚的大小与使再生的牙齿的大小而异， 但以7天 60天为优选。并未特别限定间隔构件的材质，优选对来自活体组织的压カ具有充分的硬度，例如可举出金、银、铁、铜、铝、聚こ烯、树脂、牙科用树脂、牙科用粘固剂等。本发明之再生牙齿单元的制造方法中，将再生牙胚配置于间隔构件内进行培养之步骤，以在间隔构件内填满支持载体，再将再生牙胚配置于支持载体内进行为优选。支持载体只要可于其内部培养细胞，则无特别限制，例如以凝胶状、纤维状、固体状者为优选，通过使用相关的支持载体，可进而防止于活体内对再生牙胚施加过多的压力。本发明使用再生牙齿单元制造时所使用的支持载体可举出例如胶原蛋白、琼胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、CellMatrix (商品名)、Mebiolgel (商品名)、Matrigel (商品名)、弹性蛋白、纤维蛋白、层黏蛋白(Iaminin)、细胞外间质混合物、聚こ醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/こ醇酸共聚合物(PLGA)等。其中，以具有适当的硬度及保持力的胶原蛋白、琼胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、CellMatrix、Mebiolgel>Matr i ge I、细胞外间质混合物、纤维蛋白、层黏蛋白为优选。例如可使用液体状的支持载体，在配置再生牙胚后再使其硬化。例如，以胶原蛋白溶液充满间隔构件内部，在胶原蛋白溶液内配置再生牙胚后，通过于37°C的CO2培养箱中进行培养，可使胶原蛋白凝胶化。接着，可再将置于间隔构件的再生牙胚，配置于哺乳动物的活体内进行培养。根据本发明其他的实施方式，以间隔构件制造本发明所使用的再生牙齿单元的方法，在活体内培养再生牙胚时，由于牙齿不会于活体内受到压力而损毁，可使其成长为自然的形状，可容易地制造适合缺损部位形状的牙齿。另外，使用间隔构件制造的再生牙齿单元，不仅牙齿部分，由于牙周组织部分亦不会于活体内受到压力而损毁，可使牙周组织充分发育，可制造形成牙槽骨更多的再生牙齿单元。因此，使用间隔构件制造之再生牙齿单元，可适用为最适合用于复原牙槽骨的再生牙齿单元。作为本发明之另ー实施方式，本发明所使用之再生牙齿单元的特征在干，是根据包含在哺乳动物的活体内培养再生牙胚的步骤的方法而制造，其中，在培养再生牙胚时，自哺乳动物的外部施加机械性的刺激。通过施加机械性的刺激，可促进再生牙齿单元的牙周膜的形成。机械性的刺激可举出例如震动、压迫、摩擦等，但并未限定于这些方式。例如可给予声波程度的频率(例如约20000Hz 40000Hz)的震动。因此，认为通过移植施加机械性刺激后促进牙周膜形成的
再生牙齿单元，可更好地促进牙槽骨的复原。本发明的使用间隔构件的再生牙齿单元的制造方法中，在活体内培养再生牙胚吋，以自哺乳动物的外部施加机械性的刺激为优选。本发明之牙槽骨的复原方法中，根据所要移植的再生牙齿单元的牙齿再生阶段，若已发现齿冠形成，以将齿冠配置于口腔内侧为优选。处于未发现形成齿冠之阶段吋，以将相当于齿冠部位的上皮细胞层或再生牙胚的上皮细胞层配置至口腔内侧为优选。借此，可使牙齿的前端(齿冠)位于口腔内侧，与周围的牙齿具同样的方向性，可期望再生牙齿单元的牙周组织部分与颚骨发生骨整合。本发明所使用的再生牙齿单元可用于修补动物的缺损牙齿的方法中。修复动物缺损牙齿的方法包括将前述再生牙齿单元移植至牙齿缺损部位之步骤。可制造适合缺损部位 大小及形状的再生牙齿单元再进行移植。根据使用间隔构件制造再生牙齿单元的方法，在活体内培养再生牙胚时，由于牙齿不会于活体内受到压力而损毁，可使其成长为自然的形状，而可容易地制造适合缺损部位形状的牙齿。另外，为移植至缺损部位，期望制作与缺损牙齿具有相同长度的再生牙齿时，根据本发明的牙齿制造方法，可控制牙齿长度的最大值。牙齿长度超过最大允许值时，无法直接移植该牙齿，而小于最大允许值时，在移植后可获得使其成长为期望长度的再生牙齿。本说明书中所使用的用语，是为了说明特定的实施方式而使用，并无限定发明之意图。本说明书中所使用之“包含(包括、具有、具备)”等用语，除了根据上下文应作其他理解的情况之外，是指所记述的事项(部材、步骤、要素、数字等)为存在之状态，不排除其他事项(部材、步骤、要素、数字等)的存在。若为无特别定义，本说明书中所使用之术语(包含技术用语及科学用语)，具有与本发明所属领域技术人员广泛理解的相同的意义。此处使用之用语若未特别明示出相异的定义，则应被解释为具有本说明书及相关技术领域中的意义与整合性的意义，不应被理想化，或被解释为过于形式的意义。本发明的实施方式有时需參照示意图而说明，但使用示意图时，为明确地进行说明，有时采取夸张的表现。第一、第二等用语是为了表现各种要素而使用，请理解该要素不应被限定于该用语。由于该用语是仅使用于为了区别一要素与其他要素，例如将第一要素记作第二要素，同样的，将第二要素记作第一要素，亦未脱离本发明之范围。[实施例]以下參照实施例更详细说明本发明。然而本发明可通过各实施方式而具体化，不可被解释为限定于此处所记载之实施例。<实施例I :使用间隔构件的再生牙齿单元之制作>作为本发明使用的再生牙齿单元的制作方法的ー个实例，是在制作再生牙胚后，在哺乳动物的活体内进行活体内培养，并制作再生牙齿单元。于肾被膜下移植时，为了避免肾被膜压カ的影响，适合牙齿缺损部形状，且为了可制作牙周组织充分发育的再生牙齿单元，使用间隔构件进行再生牙胚之活体内培养。切断微量吸管尖(HRI_110NEW，MolecularBio Products, SanDiego, CA, USA)以形成内径(内直径)为1.3_，高1.3_之环状(圆筒状)而制作间隔构件，并于内部填满胶原蛋白溶液后使用。对于再生牙胚，为了促进向牙根方向伸长，使齿冠侧接近间隔构件的壁面而配置，并于37°C之CO2培养箱(三洋电机，大阪，日本)中进行培养，使胶原蛋白硬化。其次将含再生牙胚的间隔构件移植至7周大的C57BL/6小鼠的两侧肾被膜下。肾被膜下移植是于肾脏被膜上切割2 3mm的切ロ，剥离肾脏被膜与肾实质，再于其间插入含再生牙胚的间隔构件而进行。比较例是将器官培养7天之再生牙胚以不使用间隔构件的方式移植至肾被膜下。移植时的照片如图I所示。另外，移植时间隔构件与再生牙胚的 位置关系示意图标于图11。于移植3周后，进行显微CT摄影，使用整合图像处理软件解析图像数据。于齿冠部以最大径作为长径，与长径正交的最大径定义为短径，井分别测量其长度，及计算其比例。使用间隔构件进行培养的实例示于图2，未使用而进行培养的实例示于图3。使用间隔构件培养之再生牙齿单元，接近正常牙齿的形态，反之未使用间隔构件培养之再生牙齿单元，长径相对于短径极端的长，为扁平形状。针对各7例的使用间隔构件培养之群(控制群)及未使用间隔构件培养之群(非控制群)測量其长短径，求得的长径/短径比结果示于图4 (右側)。再生牙齿单元之长径/短径比，在使用间隔构件培养之群(控制群实施例)为1.46±0. 16mm，未使用间隔构件培养之群(非控制群比较例)为2. 30±0. 35mm。图4(左側)，是成年小鼠的下颚第一、第二、第三臼齿(M1、M2、M3)的齿冠部并以最大径作为长径，与长径正交的最大径定义为短径并測定，亦显示求得之长径/短径比結果。Ml、M2、M3 之长径 / 短径比分别为 I. 61 ±0. 05mm(n = 5)、I. 09±0. 04mm(n = 5)、I. 12±0. 04mm(n = 5)。自上述结果可知，相对于未使用间隔构件于活体内培养之再生牙齿单元为扁平形状，使用间隔构件于活体内培养之再生牙齿单元，并不会形成扁平形状，且二者的长径/短径比之间存在显著性差別。另外，确认使用间隔构件于活体内培养之再生牙齿单元的长径/短径比与天然牙齿相同(Student’s-t test,*p < 0. 0001)。另外不仅再生牙齿单元的齿冠部分如此，再生牙齿单元的牙周组织部分与未使用间隔构件于活体内培养时相比，使用间隔构件于活体内培养时，不会形成扁平形状，确认可获得牙周组织向图中的齿冠的短径方向及长径方向两方向扩散形状的再生牙齿单元(參照图2及图3之右图)。因此，牙周组织的形状亦可通过改变间隔构件的形状(于本实施例中是间隔构件的圆筒的高度)而控制。通过调整间隔构件的大小及形状，可制作具有沿着缺损部位的形状的牙周组织的再生牙齿单元并进行移植，可使移植成功，亦有助于移植的动物牙槽骨的复原。另外，认为通过使用间隔构件，可获得牙周组织向齿冠的短径方向及长径方向两方向扩散形状的再生牙齿単元，再生牙齿因牙槽骨而有更强固的支持。摘出移植至肾被膜下30天、第60天的再生牙齿单元，进行显微CT摄影，使用整合图像处理软件解析并测定长度。未包含显微CT图像上形成的牙槽骨的范围，測量牙齿的咬合头至根尖的长度。结果示于图5。于未使用间隔构件的非控制群咬合头-根尖长于第30天为1.07±0. 20mm (n = 6)，第60天为I. 70±0. 26mm (n = 6)，牙齿长度的增加具有显著性。反之，通过间隔构件的控制群，在第30天为1.01±0. 19mm(n = 13)，第60天为
I.02±0. Ilmm(n = 10)，未发现因移植天数之长度增加(Student’s-t test,*p < 0. 0001)。自上述结果可知，使用间隔构件于活体内培养再生牙胚时，可任意调节再生牙齿的长度。<实施例2 :施加机械性刺激的再生牙胚之活体内培养>遵循实施例I之方法，将使用间隔构件进行器官培养之再生牙胚与该间隔构件一起移植至肾被膜下，机械性的刺激是自移植至肾被膜下第7天开始，以声波电动牙刷(频率31，000取001む(商标)，国际牌)于小鼠背部皮肤给予3. 9X IO4Pa的压力。(5分钟/日)。对照群未施加机械性的刺激，在30天的移植期后摘出作为比较对象。对摘出之再生牙齿单元进行与实施例I相同方法的显微CT摄影，使用3D图像解 析软件并测定牙周膜腔的宽度(有时仅简称作“牙周膜之宽”)。具体而言以3D图像上再生牙齿单元的牙根表面与形成的牙槽骨之距离为牙周膜腔的宽度，长径及短径的剖面图，分别测定6个点。其后将牙齿以4%多聚甲醒(Paraformaldehyde PFA)固定,再以10%こニ胺四こ酸ニ钠(EDTA)脱钙，以石蜡包埋。其后，制作厚度Sym的连续切片，并进行苏木精-伊红(HE)染色，进行组织学评价。组织学评价结果示于图6。图中B代表牙槽骨，D为牙本质，P为牙周膜，图中文字P相邻的线条表示牙周膜的宽度。另外图中右下角比例尺是表示IOOy m。有刺激群的牙周膜形成较无刺激群为厚，并未发现牙周膜区域的细胞有规则的排列。另外CT图像上測量牙周膜的宽度的结果示于图7。有刺激群之牙周膜的宽度为108. 5±30. 6iim(n = 33)，无刺激群之牙周膜的宽度为68. 7± 14. I y m(n = 12)(Student，s_t test,*p < 0. 0001)。自上述结果可明确得知，在活体内培养再生牙胚时，通过自外部施加机械性的刺激，可获得具有充分牙周膜组织之再生牙齿单元。<实施例3 :活体内培养所得之再生牙齿单元之颚骨移植>拔除4周龄C57BL/6小鼠下颚第一臼齿，并给予3天治愈期。其后，在相同部位进行牙龈切开与剥离，使用牙科用微马达(Viva-Mate Plus，中西，东京，日本)切削牙槽骨，形成近远中径lnrni，频舌径0. 8mm的移植窝。遵循实施例1，使用间隔构件于肾被膜下培养30天，并且遵循实施例2，在培养期间施加机械性刺激制作再生牙齿单元，将该单元埋入颚骨移植窝内，并以8-0尼龙缝线(Bearmedic,千叶，日本)缝合牙銀。图8是表示形成移植窝及移植再生牙齿单元之情況。移植再生牙齿单元至小鼠后的0天、第14天、第30天，以与上述相同方式进行显微CT摄影，并评价移植片与接受者的牙槽骨结合之情形。之后将含移植片之颚骨以4% PFA固定，再以10 %蚁酸-柠檬酸钠脱钙液进行脱钙，以石蜡包埋后，制作厚度8 u m的连续切片，并以染色进行组织学评价。图9为CT图像，图10为HE染色照片。如图9所示，在移植第14天发现移植片与接受者的下颚第二白齿牙槽骨间有部分的结合，在移植第30天发现几乎整个周边均与骨整合。图中箭头是表示再生牙齿单元。
如图10所示，在移植第30天的组织图像中，再生牙齿与下颚第二臼齿的牙周中隔牙槽骨融合，显示再生牙齿单元介由骨结合而与移植部位的牙槽骨整合之可能性。另外根据组织分析，虽发现因移植而出现偶发症，即再生牙齿的牙髓一部分钙化(16例中3例)，再生牙齿单元的牙周膜于移植后仍维持，且未发现黏连(Dental ankylosis) (16例中0例)。图中箭头是表示通过骨结合而发生骨整合，比例尺是表示100 ym，BT代表再生牙齿，NT代表天然的下颚第二臼齿。自前述结果可知，根据本发明之制造方法所制造的再生牙齿单元，移植至颚骨后生长良好。<实施例4 :对广泛性骨缺损模型之再生牙齿单元移植>拔除4周龄C57BL/6小鼠下颚第一臼齿，并给予3天治愈期。其后，在相同部位进行牙龈切开与剥离，使用牙科用微马达(Viva-Mate Plus，中西，东京，日本)切削牙槽骨，形成近远中径(mesiodistal diameter) 2. 5 3mm,颊舌径2mm,深度3mm的三面性广泛性 骨缺损模型。将遵循实施例1，配置于间隔构件内的再生牙胚于肾被膜下培养50-60天所制作之再生牙齿单元，移植至骨缺损部位，并以8-0尼龙缝线(Bearmedic，千叶，日本)縫合牙龈。图12是移植后再生牙齿单元的实体图像，CT外观图像及CT剖面图像。对移植再生牙齿单元之小鼠，在第0天、第14天、第30天、第40天进行显微CT摄影，并评价移植片及植入物于牙槽骨内的結合，以及颊侧牙槽骨的垂直的骨再生。显微CT摄影是于再生牙齿单元，以及移植再生牙齿单元的颚骨，使用实验动物用3D显微X射线CTR_mCT (Rigaku)，以90kV，150mA,剖面厚度IOmm之条件下进行，可使用图像解析软件小动物用图像汇整软件i-VIEW type R，以及高分辨率3D/4D图像解析软件Imaris(Bitplane)进行图像构建及解析。图13是对照(未移植再生牙齿单元)及实施例(移植再生牙齿单元)于0天、第14天、第30天、第40天的CT图像。使用显微CT图像，观察于刚进行移植及移植45天后的再生牙齿单元吋，与未移植再生牙齿单元之对照比较，因移植再生牙齿单元而发现颊侧牙槽骨量显著性复原，同时显示再生牙齿单元已整合。图14是表示对照(未移植再生牙齿单元)及实施例(移植再生牙齿单元)于移植后第45天的CT图像。图像中刚移植后的牙槽骨上端部以虚线表示，移植后第45天的牙槽骨上端部以实线表示。进而，针对对照(未移植再生牙齿单元)及实施例(移植再生牙齿单元)，測定移植45天的牙槽骨再生量。亦即于缺损部位或移植部位进行经时的CT摄影，通过使用整合画面图像处理软件进行解析，测定自移植前至移植后増加的牙槽骨体积，測定再生的牙槽骨量。測定结果示于图15。根据测定牙槽骨的再生量，在移植再生牙齿单元的实例中，与未移植再生牙齿单元的对照组相比，显示牙槽骨再生量有显著性増加。进而于其他的实施方式中，针对对照(未移植再生牙齿单元)及实施例(移植再生牙齿单元)，在移植第0天、第49天的CT图像示于图16。图16的右图将移植49天后之牙槽骨上端部的水平线，在对照及实施例的照片中以虚线表示。対照的CT图像中，实际的牙槽骨的上端部与实施例之牙槽骨的上端部的垂直方向的差，通过ニ个箭头表示。如图所示，显示通过移植再生牙齿单元至牙齿缺损部，可使牙槽骨在垂直方向复原。由该结果可知，对于一般植入物与牙胚移植无法解决的广泛性骨缺损，通过移植再生牙齿单元，暗示可再生缺损部的牙槽骨，同时通过骨性结合亦可使牙齿再生。


本发明公开了对牙齿缺损的哺乳动物的牙槽骨进行复原的方法。所述方法包括将再生牙齿单元移植至所述牙齿缺损部位的步骤。所述再生牙齿单元的特征在于除了齿冠部分以外还具有牙周组织部分。