专利名称：链格孢属真菌xnsp-MG1及其应用的制作方法白藜芦醇(resveratrol，3, 4’，5_三羟基二苯乙烯)是葡萄酒中主要的生物活性多酚。自1992年被认定为葡萄酒中预防心血管疾病的重要成分以来，白藜芦醇越来越多地被证明具有预防和减缓癌症、心血管疾病及缺血性损伤等多种疾病的功能，并有增强抗逆性和延长从酵母到脊椎动物多种生物生命的功效。 目前，人们普遍认为葡萄原料是决定酒中白藜芦醇含量的主要因素。虽然人们也尝试了其它方法来提高葡萄在采后和葡萄酒酿造过程中的白藜芦醇含量，如在葡萄采后进行短时低温处理、紫外照射等方法可以提高葡萄中白藜芦醇含量，但其提高幅度有限。也有人将植物中控制白藜芦醇合成的关键酶基因转入酵母中，从而在葡萄酒发酵过程中合成白藜芦醇，但表达结果尚不够理想。
针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种新的链格孢菌，该菌能够在发酵的过程中产生大量的白藜芦醇。为实现上述目的，本发明的技术方案如下 一种链格孢属(Alternaria. sp. ) xnsp-MGl (以下简称MGl),于2011年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M2011348，保藏地址中国武汉武汉大学。本发明还有一个目的是提供MGl在发酵产生白藜芦醇中的应用。本发明的MGl是从酿酒葡萄梅洛特的葡萄梗中分离出的，MGl发酵能够产生大量的白藜芦醇，而且生产能力稳定。图I植物内生菌分离纯化至形态学鉴定中所用培养基的作用流程图。图2白藜芦醇混标色谱图。图3菌株MGl的发酵液的液相色谱图。图4碳源种类对菌株MGl生长的影响直线。图5氮源种类对菌株MGl生长的影响直线。图6金属离子对菌株MGl生长的影响直线。图7培养温度对菌株MGl生长的影响曲线。图8菌株MGl菌落特征显微镜图。图9a b菌株MGl的分生孢子和分生孢子着生方式形状图。图10利用菌株MGl的ITS区基因序列构建的系统发育树。图11菌株MGl在液体发酵中的菌体生长曲线(□)与白藜芦醇产生曲线。图12 a d分别是接种量、装液量、摇床转速和培养温度对菌株MGl发酵产生白藜芦醇影响的曲线。图13 a c分别是接种量与装液量、装液量与摇床转速、装液量与培养温度间交互作用对菌株MGl发酵产生白藜芦醇影响的曲线。


以下结合发明人给出的附图和具体试验例及具体实施例来进一步说明本发明MGl的有益效果和制备方法。实施例I I材料与方法
I.I材料
I.I. I植物分离源梅洛特葡萄，于2010年8月初采自西北农林科技大学葡萄种植资源圃，八成熟。I. I. 2培养基(I)菌种分离纯化用培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏I号琼脂培养基。(2)液体培养基马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，高氏一号液体培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基。(3)菌种鉴定培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)，察贝克氏培养基(Czapek)。I. I. 3主要仪器与试剂分析纯级无水乙醇(天津博迪化工股份有限公司)，分析纯级乙酸乙酯(天津博迪化工股份有限公司)，色谱纯级甲醇(sigma公司)，色谱纯级乙腈(sigma公司)，白藜芦醇标品纯度99% (中检所)，Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux 公司)，Fungal Identification PCR Kit (D317)试剂盒(大连宝生物公司)，分子生物学级琼脂糖(Invitrogen公司)。Motic BA 400数码成像光学显微镜(麦克奥迪公司)，TC-200型PCR扩增仪(美国伯乐公司)，Bio-Rad全自动凝胶成像系统(美国伯乐公司)。高效液相色谱系统LC-15C液相送液单元、SPD-15C紫外可见双波长检测器、CBM-20A控制器、SIL-IOAF自动进样器(日本岛津公司)，数)11(1&811型(18色谱分析柱(2504.6臟)(日本岛津公司)，CT0-15C柱温箱柱温箱(日本岛津公司)。I. 2实验方法
I.2. I MGl的分离取新鲜的梅洛特葡萄的果实皮层、梗部及穗轴，将其在70%酒精中浸泡lmin，然后用3%次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，再用无菌水清洗3次；之后使用无菌解剖刀将这些组织切成约5mmX 5mm大小的小块，切面向下，每个部位的组织块都分别放置于3种分离纯用培养基上，每个处理设2个重复，于28°C培养3-7d。培养期间，将长出的菌丝体或菌落用接种针及时转接到与分离用培养基相应的新鲜固体培养基上，并用划线法进行分离纯化，直至纯种。为了确保表面消毒彻底，将最后一次清洗水分别涂布于不同培养基上，在相同条件下进行培养，作为对照。如对照中无菌生长，则说明表面消毒彻底，能够保证分离到的真菌是植物内生菌而不是空气中或植物分离源表面的附着菌。将用不同分离培养基获得的菌种转移至与其分离用培养基相同固体斜面上，在28°C下培养5d后取出，在4°C下保存，以供后续检验工作所需。1.2.2 MGl的筛选将分离纯化后的各微生物菌种用三点接种法接种到与其保存用斜面培养基相同的固体平板培养基上，在28°C下培养活化5d后，用无菌水制成孢子或细菌悬浮液(血球板计数板计数，控制其浓度约为I X 107/ml);再取5ml上述悬浮液接种到与各菌种分离纯化时所用培养基相应的液体培养基中(250ml三角瓶装料100ml)，在28°C、IOOr/ min的条件下发酵7d。发酵结束后,将培养物离心(4000 r/min,离心15 min),取上清液保存待用。收集沉淀下来的菌体，在_40°C下冷冻IOmin后研磨粉碎，将研碎的菌体与80%的乙醇水溶液以I :15的比例进行混合，在28°C 下浸泡IOh后，用70°C水浴回流2h，再进行过滤,收集滤液,残渣用15倍体积的80%乙醇溶液进行重新浸泡、水浴回流、过滤、收集滤液，如此重复总共3次。最后，将每次收集到的浸提滤液与发酵液进行合并，再在60°C下减压浓缩至IOOmL,再用50mL乙酸乙酯萃取3次；取乙酸乙酯层，用3%NaHC03 (体积比)溶液洗涤3次，弃去NaHCO3溶液层；残液在50°C下减压浓缩至干；残留物用2. OmL甲醇溶解后，过O. 45 μ m微孔滤膜，用高效液相法检测其中的白藜芦醇浓度。液相检测白藜芦醇的检测条件使用C18柱，采用二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为水。起始为5% A, 95% B,保持5min ；28min时调整A为60%，B为40% ；33min时A为85%，B为15%，保持2min ； 40 min时A为5%，B为95% ;最后，平衡柱子，进下一个样。进样流速为I. OmL/min,柱温为30°C,检测波长为306nm ;进样体积为20 μ I。根据白藜芦醇标准品出峰时的保留时间对样品中白藜芦醇进行定性分析，并根据峰面积值计算样品中反式白藜芦醇含量。I. 2. 3 xnsp-MGl的分类鉴定结合菌种在固体培养基上的形态学特性、微观特性及分子生物学特性对其进行分类鉴定。选用点接法将分离到各菌种接种到鉴定培养基上，进行插片培养。其中，链格孢属用马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA，马铃薯200g，胡萝卜25g，琼脂 20g，水 1000ml,自然 pH)，曲霉用 Czapek 培养基(NaNO3 2g，K2HPO4 lg, KCl 0. 5g，MgSO4
O.5g，FeSO4 0.018，蔗糖3(^，琼脂15 2(^，水1000ml,自然pH)，其它真菌用PDA培养基(马铃薯200g，水1000ml，葡萄糖10_20g，琼脂17_20g，自然pH)作为形态鉴定用培养基。整个分离纯化、产白藜芦醇能力检验及形态学鉴定中所用培养基的流程如图I所
/Jn ο选取一株白藜芦醇产量最高的微生物菌株进行分子生物学分类鉴定。即通过rDNAITS区序列分析进行分子确认。操作时，先将供试菌株接种于PDB培养基，在28°C、IOOr/min下培养3d后离心(4000 r/min，离心15 min)，收集沉淀下来的菌丝体于_40°C下冻存。使用时，取出冻存的菌丝体，在液氮条件下充分研磨后使用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌种的总DNA ;之后用Fungal Identification PCR Kit (D317)试剂盒进行ITS区全序列(包括ITSl、5. 8S rDNA、ITS2)PCR扩增，扩增条件为94°C预变性IOmin ；94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C下延至7min，终止温度4°C。PCR完成后，取5. O μ IPCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下检测。I. 2. 3系统发育树的构建将测得的ITS区基因序列提交给GenBank，并用Blastn 功能将测得的 rDNA 序列在 GenBank ( http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中进行同源性比对，提取同源性高的序列并使用Phylip (version 3. 68)软件包构建系统发育树，确定待测菌株与库中已有记录间的亲缘关系。2结果与分析
2.I MGl的筛选
将用各种培养基分离得到的菌株进行液体发酵后，按照I. 2. 2所述方法进行处理，获得发酵液提取液。再用HPLC按照I. 2. 2所述液相条件分析其发酵产生白藜芦醇的能力。白藜芦醇标样的液相图谱如图2所示，A :反式白藜芦醇；B :顺式白藜芦醇。菌株MGl的发酵液的液相色谱图如图3所示，A :反式白藜芦醇。检测结果发现，在所分离到的30株内生菌中，只有7株能在发酵条件下产生白藜芦醇，其中3株是用Gause’s I培养基从葡萄轴中分离得到的，其它4株均来自于葡萄皮(I株用Gause’s I分离得到，3株用PDA培养基分得到K表I)。在发酵产白藜芦醇的菌株中，5株在发酵液中的白藜芦醇产量小于40 μ g/1，只有2株菌的产量较高，分别为MGl (97μ g/1)和菌株MP15 (951^/1)。其中MGl是 用Gause’s I培养基从葡萄轴中分离得到，MP15是用PDA培养基从葡萄皮中分离得到。这说明(1)能够发酵产生白藜芦醇的葡萄内生菌主要是内生真菌；(2)葡萄中能够发酵产生白藜芦醇的内生菌主要存在于葡萄轴和葡萄皮中；(3)采用高氏I号培养基和PDA培养基均能获得白藜芦醇产量较高的葡萄内生真菌。表IMGl的形态特征


本发明公开了一种链格孢属 (Alternaria.sp.)xnsp-MG1，该菌株已于2011年10月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNOM2011348。该菌株MG1是从酿酒葡萄梅洛特的葡萄梗中分离出的，其发酵不仅能够产生大量的白藜芦醇，而且生产能力稳定。