抑制mgc-803细胞的手型金纳米团簇的制备及其用途【技术领域】的制备和生物医学应用，具体涉及一种抑制MGC-803细胞的手型金纳米团簇的制备及其用途。[0002]胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的第二位，死亡率极高。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时，病变多已属晚期。因此，及时诊断出胃癌的早期症状，及时就医，对胃癌的诊疗具有非常重要的意义。近年来纳米技术以及纳米材料的应用为靶向识别以及治疗体内肿瘤提供了很好的方法。目前肿瘤临床诊治的主要问题是:肿瘤的诊断与治疗分离，绝大部分抗癌药物不能有效区分肿瘤细胞和正常细胞，结果带来了系统性的毒性和其它副作用。虽然现在纳米靶向药物递送系统的研究发展很快，但普遍存在探针构建复杂，重复性不稳定等缺点。[0003]近年来，金纳米团簇的可控制备以及生物医学应用受到越来越多的重视，Rongchao Jin等通过动力学和热力学的条件控制，精确可控合成Au25金纳米簇(Wu,Z., MacDonald, M.A., Chen, J., Zhang, P., &Jin, R.(2011).Journal of theAmericanChemical Society, 133 (25), 9670-9673);此外 JianpingXie 等人利用牛血清白蛋白 BSA 作为模板，37°C的碱性水溶液中合成了高量子产率的金纳米团簇(Xie，J.，Zheng, Y.，&Ying，J.Y.(2009).Journal of the American Chemical Society, 131(3), 888-889)。LiShang在Nano Today上发表的综述文章指出金纳米团簇由于具有超小的粒径，很好的生物相容性以及优异的光稳定性等优点，在超灵敏生物分子检测、生物体系荧光标记以及其他生物医学领域具有重大的潜在应用价值。经检索发现在现有的技术中，尽管有很多利用生物分子如蛋白质和核酸作为保护剂来合成荧光金纳米团簇的文献很多，但目前还没有采用自然界不常见的D构型的谷胱甘肽分子来合成荧光发射峰在650纳米的金纳米团簇的报道。经检索发现在现有的技术中，尽管有报道使用D构型的谷胱甘肽分子合成CdTe (碲化镉)量子点，但由于Cd元素的重金属毒性，严重限制了其在生物体系中的应用，而我们合成的金纳米团簇没有引入任何有毒的元素与物质，其中金元素具有很好的生物相容性。D构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米簇比生物体系中普遍存在的L构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米团簇更有效的抑制胃癌细胞MGC-803的生长与增殖，并显著促进MGC-803细胞的死亡，这种抑制作用在正常的胃粘膜上皮细胞GES-1中却几乎没有，因此，制备的D构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米簇具有特异性的抑制胃癌肿瘤细胞MGC-803的作用，是一种有应用前景的治疗胃癌的纳米材料。
[0004]本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种抑制MGC-803的手型金纳米团簇的制备及其用途。具体涉及一种以D构型的谷胱甘肽分子包裹的手型金纳米团簇的合成，以及作为纳米探针特异性的对胃癌细胞MGC-803进行杀伤治疗的用途。[0005]为实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现的:[0006]第一方面，本发明涉及一种抑制MGC-803的手型金纳米团簇的制备方法，所述方法包括如下步骤:[0007]A、将摩尔比为1: 3的氯金酸和D-GSH置于超纯水中，经室温混合和搅拌，置于冰浴中冷却至o°c，形成白色悬浊液；
[0008]B、在所述白色悬浊液中快速加入四丁基硼氢化铵溶液，并冰浴剧烈搅拌，形成含有D-GSH包裹的金纳米团簇的溶液；
[0009]C、离心去除步骤B所得溶液中的不溶物，上清液中的金纳米团簇通过加入过量的冷的乙醇加以沉淀，然后离心收集金纳米团簇，重复乙醇沉淀步骤若干次，冷冻干燥，即得所述手型金纳米团簇固体。
[0010]优选地，步骤A中，所述氯金酸溶液的浓度为10mM，D-GSH的浓度为150mM ;所述混合和搅拌的时间为20分钟。
[0011]优选地，步骤B中，所述四丁基硼氢化铵与氯金酸的摩尔比为5: 1。
[0012]优选地，步骤B中，剧烈搅拌速度为1200~2000rpm，搅拌时间为I~4小时。
[0013]优选地，步骤C中，所述沉淀具体为:用3倍体积于金纳米团簇上清液的冷的乙醇沉淀，并1000Orp m离心15分钟。
[0014]第二方面，本发明还涉及一种上述的方法制得的手型金纳米团簇在用作特异性抑制胃癌细胞MGC-803生长与增殖的纳米探针中的用途。
[0015]第三方面，本发明还涉及一种上述的方法制得的手型金纳米团簇在用作促进胃癌细胞MGC-803死亡的纳米探针中的用途。
[0016]第四方面，本发明还涉及一种上述的方法制得的手型金纳米团簇在制备治疗胃癌的纳米靶向药物中的用途。
[0017]本发明发现，D构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米簇比生物体系中普遍存在的L构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米团簇更有效的抑制胃癌细胞MGC-803的生长与增殖，这种抑制作用在正常的胃粘膜上皮细胞GES-1中却几乎没有，因此，制备的D构型的谷胱甘肽分子合成的金纳米簇具有特异性的抑制胃癌肿瘤细胞MGC-803的作用，是一种有应用前景的治疗胃癌的纳米材料。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明操作简单，反应条件温和，合成的金纳米团簇具有良好的水溶性和稳定性，最大发射峰在650纳米，最大激发峰在520纳米。能够有效的阻止MGC-803的细胞周期，其中G2/M期的细胞比例大幅增加，并最终促进MGC-803细胞的坏死。



[0019]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0020]图1为实施例1中的D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇的高分辨率透射电镜图；
[0021]图2为实施例2中的L与D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇圆二色谱图；
[0022]图3为实施例3中的D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇对MGC-803细胞周期的阻滞图；其中，上图为没有加金纳米团簇处理的对照组，下图为500μ g/ml的D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇对MGC-803细胞周期的阻滞；
[0023]图4为实施例4中D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇对MGC-803与GES-1细胞存活率的影响；
[0024]图5为MGC-803与GES-1细胞GSTPl启动子区域甲基化状态的检测。

[0025]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。[0026]本发明通过弱还原剂四丁基硼氢化铵的加入以及冰浴的低温环境，降低了合成过程中的成核以及生长速度，使合成的金纳米团簇粒径均一具有良好的分散性，以及优良的荧光光学性质。合成过程中的配体分别采用一对手型谷胱甘肽L-GSH和D-GSH，其中L-GSH和 D-GSH 互为对映异构体，L-GSH 的结构组成为 N- y -L-glutamyl-L-cysteiny 1-glycine,D-GSH的结构组成为N- Y -D-glutamyl-D-cysteinyl-glycine。将合成并纯化好的两种手型金纳米团簇分别与人胃癌细胞MGC-803与人胃粘膜上皮细胞GES-1共孵育，其中D-GSH合成的金纳米团簇对MGC-803细胞具有浓度依赖的生长抑制作用，而对GES-1细胞却没有明显的生长抑制作用。进一步的研究表明，MGC-803细胞GSTPl启动子区域的高度甲基化，使GSTPl的表达被抑制，无法发挥清除活性氧的功能，而D-GSH合成的金纳米团簇(AuNCS@D-GSH)进入胃癌MGC-803细胞后相比L-GSH合成的金纳米团簇(AuNCs@L-GSH)会产生明显的氧化应激反应，大量活性氧的产生以及GSTPI的表达的缺陷，使MGC-803细胞的线粒体内膜电位降低，细胞周期受阻，继而坏死。具体见以下各实施例:
[0027]实施例1
[0028](I)氯金酸与D型谷胱甘肽分子混合液的制备
[0029]将IOmllOmM的氯金酸溶液与2mll50mM的D型谷胱甘肽溶液混合并在室温25°C下搅拌20分钟。然后置于冰浴中冷却至0°C，形成白色的悬浊液。
[0030](2)通过弱还原剂四丁基硼氢化铵的还原作用在冰浴环境中合成金纳米团簇
[0031]在上述白色的悬浊液中快速加入四丁基硼氢化铵溶液，并冰浴剧烈搅拌4小时后得到D-GSH包裹的金纳米团族。
[0032]加入的四丁基硼氢化铵溶液的量为166.67mM, 3ml，合成温度条件为冰浴，搅拌速度为1200-2000rpm，继续搅拌时间为4小时
[0033](3)第三步，将合成后溶液的不溶物通过离心去除，上清溶液中的金纳米团簇通过加入过量的冷的乙醇加以沉淀，然后离心收集金纳米团簇，重复乙醇沉淀步骤两次，得到纯净的金纳米团簇，并冷冻干燥得到金纳米团簇固体。(L型谷胱甘肽包裹的金纳米团簇按上述的方法进行合成。)
[0034]所诉的沉淀离心金纳米团簇的是指:用3倍体积于金纳米团簇上清液的冷的乙醇沉淀，并1000Orpm离心15分钟。重复以上乙醇沉淀步骤两次，得到纯化后的金纳米团簇。
[0035]将上述制备的金纳米团簇用超薄碳膜铜网制样，JEM-2100F场发射高分辨透射电镜观察金纳米团簇颗粒尺寸和形貌，透射电镜图见图1。由图1可知，金纳米团簇粒径均一且直径约2纳米。
[0036]实施例2、金纳米团簇手性的测定
[0037]合成的金纳米团簇的圆二色谱在Jasco J-815型圆二色谱仪上测定，温度为室温25°C，所用石英比色皿的光路长为10mm，带宽为lnm，扫描速度为50nm/min，扫描范围为200-500nm，取扫描三次的均化值为最终值，谱图见图2。由图2可知，D与L构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇的圆二色谱信号具有完美的镜像对称的特点，说明分别成功的合成了两种构型的谷胱甘肽分子包裹的金纳米团簇。
[0038]实施例3、细胞周期的测定
[0039]将实施例1合成好的金纳米团簇与MGC-803细胞共孵育12小时后，测定细胞周期。
[0040]所述细胞周期测定方法为:将MGC-803细胞按照2 X IO4/孔的密度种植在六孔板中，贴壁后加入一定量的金纳米团簇，使金纳米团簇溶液最终浓度为500 μ g/ml，共孵育12小时后，胰酶消化并离心收集细胞，每孔收集的细胞加入1ml预冷的70%的乙醇，轻轻吹打混匀，4°C固定24小时。1000g左右离心3-5分钟收集细胞，并加入1ml预冷的PBS重悬细胞。每管加入碘化丙叮(PO与RNaseA的浓缩液并充分混匀，使PI终浓度为50 μ g/ml, RNaseA终浓度为100 μ g/ml，37 °C避光孵育30分钟后流式细胞仪检测。流式结果见图3。由图3可知，相比较对照组，500 μ g/ml D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇处理过的MGC-803细胞处于G2/M期的比例大幅增加。
[0041]实施例4、细胞存活率的测定
[0042]将实施例1合成好的金纳米团簇分别与MGC-803和GES-1细胞共孵育24小时，然后用MTT比色法测定细胞存活率。
[0043]所述共孵育方法为:将MGC-803与GES-1细胞按照5X IO3/孔的密度种植在96孔细胞培养板中，贴壁后加入一定量的金纳米团簇，金纳米团簇溶液的最终浓度为10、50、100、250、500、1000μ g/ml，每个浓度设置三个复孔，对照组为没有加金纳米团簇的正常培养的细胞。共孵育24小时后，MTT比色法测定细胞存活率。细胞存活率见图4。由图4可知，在相同的浓度下，D构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇处理过的MGC-803细胞的存活率明显低于L构型的谷胱甘肽合成的金纳米团簇处理过的细胞。
[0044]实施例5、M6C_803与6ES-1细朐GSTPl启动子区域甲某化状杰检测
[0045]分别抽提MGC-803、GES-1与MCF-7细胞的基因组DNA进行GSTPl启动子区域甲基化状态检测，其中GSTPl启动子区域高度甲基化位的MCF-7细胞作为阳性对照，以水为样本作为阴性对照。上述样品采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(采购自北京天漠科技开发有限公司)进行处理，取500ng基因组DNA到PCR管里并在PCR仪中进行一下步骤操作:(I) 98°C方式10分钟；(2)64°C放置2小时；(3)立刻放在4°C两小时。经过处理转变的DNA样品按照试剂盒说明书上的步骤进行纯化，然后取经过纯化后的DNA样品的1/10作为模板进行甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR的操作步骤为:95°C总变性3分钟，然后94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，并进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。其中GSTPl位点甲基化引物的正向序列为:5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’ (如SEQ ID N0.1所示)，反向序列为:5’ -GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’ (如 SEQ ID N0.2 所示);GSTP1 位点非甲基化引物的正向序列为:5，-GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3，(如 SEQ ID N0.3 所示)，反向序列为:5，-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3，(如 SEQ ID N0.4 所示)。PCR 产物于 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后紫外灯下观察拍照，见图5 ;由图5可知，MGC-803细胞的GSTPl启动子区域高度甲基化。
[0046] 以上对本发 明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。