专利名称：造血祖细胞的制备方法及其专用培养基的制作方法人胚胎干细胞有自我更新和分化为所有体细胞的能力(Thomson，J. Α., Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , Waknitz, Μ. Α. , Swiergiel, J. J. , Marshall, V. S., and Jones, J. Μ. (1998). Embryonic Stem Cell Lines Derived from HumanBlastocysts. Science观2，1145-1147)。这些能力意味着人胚胎干细胞可以作为人类中胚层和造血系统发育的研究平台。进而，还可以为人类造血细胞的临床移植提供稳定的供体细胞。目前已有多个实验室报道了人胚胎干细胞定向分化为造血细胞的方法(Murry，C. Ε.，and Keller, G. (2008). Differentiation of Embryonic Stem Cellsto Clinically Relevant Populations :Lessons from Embryonic Development. Celll32,661-680)。这些方法虽然都由人胚胎干细胞分化产生了造血干/祖细胞，但是它们的分化过程都是不确定的。这种不确定主要表现在采用了基质细胞共培养和血清培养基的分化体系，如滋养层细胞共培养，或含胎牛血清的培养液培养；没有完全模拟体内造血系统的发育过程。造血-内皮前体细胞(hemangioblast)是指在造血发育过程中产生的一类同时具有向造血细胞和内皮细胞两个方向分化能力的前体细胞(Xiong，J.-W. (2008). Molecular and developmental biology of the hemangioblast. DevelopmentalDynamics 237，1218-1231.)。鉴于目前的研究均没有完全模拟体内造血系统的发育过程，因此，人胚胎干细胞的体外分化仍是研究的热点。
本发明的一个目的是提供一种用于诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基。本发明提供的诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基，由分化培养基I，分化培养基II和分化培养基III组成；分化培养基I为分化培养基I-I或分化培养基1-2 ；分化培养基II为分化培养基II-I或分化培养基II-2 ；分化培养基III为分化培养基III-I 或分化培养基II1-2;所述分化培养基I-I为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白-4(BMP4)得到的培养基；所述分化培养基I-I中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度为 10-100ng/ml ；所述分化培养基1-2为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白-4和 Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度为 10-100ng/ml，所述 Wnt3a 的终浓度为 50_150ng/ml ；所述分化培养基II-I为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II-I中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ ml ；所述分化培养基II-2为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ml ；所述分化培养基III-I为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III-2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸(RA)得到的培养基；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的终浓度为1-5 μ M ；所述骨形态发生原蛋白-4(ΒΜΡ4)可以为人骨形态发生原蛋白_4，也可以为鼠骨形态发生原蛋白-4;所述Wnt3a可以为人Wnt3a，也可以为鼠Wnt3a;所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)可以为人血管内皮细胞生长因子或者鼠血管内皮细胞生长因子；所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以为人碱性成纤维细胞生长因子或者鼠碱性成纤维细胞生长因子；所述第一阶段分化培养基为在用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基上添加牛血清白蛋白(BSA)得到的培养基；所述第一阶段分化培养基中的所述牛血清白蛋白的终浓度为 0. 1-lmg/ml ；所述第二阶段分化培养基为在所述第一阶段分化培养基上添加胰岛素-转铁蛋白-硒盐(ITS)、维生素C酸和硫代甘油得到的培养基；所述第二阶段分化培养基中的所述胰岛素-转铁蛋白-硒盐的终浓度为0. 5-1. 5% (体积百分含量)，所述维生素C酸的终浓度为0. 1-lmmol/l，所述硫代甘油的终浓度为0. 1-lmmol/l ；所述第三阶段分化培养基为将所述第二阶段分化培养基中的胰岛素-转铁蛋白-硒盐替换成B27添加剂(B27)得到的培养基；所述第三阶段分化培养基中的所述B27 添加剂的终浓度为0. 5-1. 5% (体积百分含量)。所述分化培养基I-I和1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度均可为10、 20、40、50、60、80或100ng/ml，所述分化培养基1_2中的所述Wnt3a的终浓度可为50、60、 80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培养基II-I和II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度均可为 50、60、80、100、120或150ng/ml，所述分化培养基II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度可为 50、60、80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的终浓度可为1、1. 2,1. 5、2、2. 5、 3、4 或 5μΜ;所述第一阶段分化培养基中的牛血清白蛋白的终浓度可为0. 1、0.2、0.4、0.5、 0. 6、0· 8 或 lmg/ml ；所述第二分化培养基中的所述维生素C酸的终浓度可为0. 1、0.2、0.4、0.5、0.6、 0. 8或lmmol/1，所述硫代甘油的终浓度可为0. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6、0. 8或lmmol/1，所述胰岛素-转铁蛋白-硒盐的终浓度可为0. 5%,0. 7%,0.9%U%>1. 2%、1.4%或1. 50% ；所述第三阶段分化培养基中的所述B27添加剂的终浓度可为0.5 %、0. 7 %、 0. 9%Λ%Λ. 2%Λ. 4%或 1. 50%。所述分化培养基I-I和1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度均优选为20-80ng/ml,尤其优选为50ng/ml，所述分化培养基1_2中所述Wnt3a的终浓度优选为 80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml ；所述分化培养基II-1和II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度均优选为80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml，所述分化培养基II-2中所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度优选为80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml ；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的浓度优选为1. 2-3μΜ，尤其优选为2μΜ ；所述第一阶段分化培养基中牛血清白蛋白的终浓度优选为0.4-0. 6mg/ml，尤其优选为0. 5mg/ml ；所述第二阶段分化培养基中的所述维生素C酸的终浓度优选为 0. 2-0. 8mmol/l，尤其优选为0. 5mmol/l，所述硫代甘油的终浓度均优选为0. 2-0. 8mmol/l, 尤其优选为0. 45mmol/l，所述胰岛素-转铁蛋白-硒盐的终浓度优选为0. 7-1. 2%，尤其优选为；所述第三阶段分化培养基中的所述B27添加剂的终浓度优选为0. 7-1.2%，尤其优选为；。上述基础细胞培养基可选自下述至少一种培养基α -MEM、DMEM、DMEM/F12、 RPMI1640、F12 或 IMDM，可为 IMDM、α -MEM、DMEM、DMEM/F12、F12、RPMI1640 或其组合，优选为IMDM和F12的组合。本发明的第二个目的是提供一种采用诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基诱导人胚胎干细胞分化成造血祖细胞的方法，它包括以下步骤1)是将人胚胎干细胞在任一的所述分化培养基I-I或所述分化培养基1-2中培养；2)将由步骤1)获得的细胞转入任一所述的分化培养基II-I或所述的分化培养基 II-2中培养；3)将经步骤2)获得的细胞转入任一所述的分化培养基III-I或所述的分化培养基III-2中培养，获得造血祖细胞。所述人胚胎干细胞具体可为表1所示的可从商业途径得到的人胚胎干细胞系，如表1。表1.人胚胎干细胞系本发明提供一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基，所述专用培养基由分化培养基I-1或分化培养基I-2，分化培养基II-1或分化培养基II-2和分化培养基III-1或分化培养基III-2组成；所述分化培养基I-2为在第一阶段分化培养基中添加人BMP4和人Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基II-2为在第二阶段分化培养基中添加人血管内皮细胞生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基III-1为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III-2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸(RA)得到的培养基；本发明提供的方法产生的造血祖细胞适合作为人原代造血祖细胞的替代品。