具有抗hiv活性的取代1,2,3－三唑并嘧啶新化合物，制备方法及用途制作方法

杨铭, 袁德凯, 庞瑞芳, 张春雷

2007年7月11日

2005年3月18日

2005年3月18日

北京大学

A61P31/18GK1995042SQ20061017028

hiv 活性 取代 具有

1.式(II)化合物 其中R4所代表的基团选自(CH2)nCONHR5，其中R5代表的基团选自氨基直链或支链(C1～C6)烷基、取代氨基直链或支链(C1～C6)烷基，单胍基直链或支链(C1～C6)烷基，二胍基直链或支链(C1～C6)烷基，n＝1～4，(CH2)nR5，(CH2)nNHR5，(CH2)nOR5，(CH2)nSR5，(CH2)nCOR5，其中的R5是如上定义的，Ra、Rb彼此独立代表的基团选自氢原子、直链或支链(C1～C6)烷基、氨基、直链或支链烷基(C1～C6)氨基、芳基、杂环、芳胺基、杂环胺基，所有化合物及其在药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐2.根据权利要求1的式(II)化合物，它是R4为(CH2)nCONHR5，其中n＝1，R5为2-氨基乙基、3-氨基丙基、2-胍基乙基或3-胍基丙基，Ra为N，N-二乙基胺基，Rb为甲基的化合物任意其中之一，及其与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐3.式(II)化合物的制备方法，其特征在于使用(III)化合物作为原料 其中，Ra、Rb是如上定义的，按照有机合成常规的取代条件，与氨(胺)反应得到式(IV)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的，按照有机合成中硝基还原的反应条件，将式(IV)中的硝基结构还原为氨基胺基)，得到式(V)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的，按照有机合成中的环合反应条件，使该式(V)化合物与酸和亚硝酸钠作用得到式(VII)化合物 其中Ra、Rb是如上定义的，按照有机合成中烷基化的反应条件，使(VII)化合物与氯乙酸乙酯在碱催化下反应，得到式(IX)化合物 其中Ra、Rb是如上定义的，按照常规的酰胺化条件，用式(XI)化合物处理式(IX)化合物R5aNHR5b(XI)其中R5a是氢，R5b是氨基(C1-C6)烷基得到式(IIa)化合物，即式(II)化合物的一个特定例子 其中Ra、Rb、R5a、R5b是如上定义的将式(IIa)化合物置于式(XII)化合物作用下 得到式(IIb)化合物，即式(II)化合物的一个特定例子 其中Ra、Rb、是如上定义的，R5a是胍基烷基4.药物组合物，包含至少一种根据权利要求任意一项的式(II)化合物作为活性成分或与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐作为活性成分，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体5.根据权利要求1至2任意一项的式(II)化合物作为抗爱滋病用途

本发明涉及取代嘌呤和其类似物取代1，2，3-三唑类新化合物该类新化合物对HIV-1 mRNA的TAR RNA区域具有结合作用，能够抑制HIV-1 Tat与TARRNA的结合，从而干扰病毒的复制，产生抗病毒活性抑制HIV-1体外复制实验结果表明，在不显示毒性的剂量下，该类化合物显示了很好的抗病毒活性，这与体外转录的实验结果相吻合HIV TAR RNA是存在于HIV-1病毒新生mRNA 5’末端的基因组结构，其在HIV-1病毒复制中的作用是与HIV-1 Tat蛋白结合，从而激活病毒的转录，促进病毒转录物延长，提高完整mRNA的转录水平，使病毒得以有效复制目前抗HIV-1药物的主要针对病毒复制和转录两个阶段的关键酶蛋白酶和逆转录酶，但这两种酶由于病毒本身的变异和遗传异质性而极易产生耐药性，在一定程度上限制了此类药物的使用和疗效因此，研究者再次回到HIV-1病毒的基础研究中，发现了Tat蛋白与TAR RNA的结合在HIV-1生命周期中的重要作用因此HIV-1 Tat TAR RNA相互作用成为近年来HIV研究领域的热点之一目前，国外有一些研究机构在从事以Tat TAR RNA相互作用为靶抗HIV药物的研究；本课题组是国内最早开展对该靶点进行药物设计合成及抗病毒活性评价的课题组，已经申请相关专利，并发表多篇研究论文因此，如果能以TAR RNA为作用靶点，发现一种新的抗HIV-1的药物，就可以达到医治爱滋病患者的目的本发明中所涉及的化合物的分子结构为全新结构，经生物活性评价证明是能有效抗HIV-1的物质，因此可用于爱滋病的治疗本发明更确切的涉及(I)和(II)化合物 其中R1所代表的基团选自S(CH2)nR3，其中R3代表其中R3代表氨基(C1～C6)烷基、取代氨基(C1～C6)烷基，单取代胍基(C1～C6)烷基，双取代胍基(C1～C6)烷基，各基团的烷基部分可以是直链或支链的，n是1～4的整数，S(CH2)nCOR3，S(CH2)nCONHR3，(CH2)nR3，(CH2)nNHR3，(CH2)nOR3，(CH2)nSR3，(CH2)nCOR3和(CH2)nCONHR3其中的R3是如上定义的，R2所代表的基团选自氢、直链或支链(C1～C6)烷基、芳基、杂环、胺基直链或支链(C1～C6)烷基、羟基直链或支链(C1～C6)烷基，芳基直链或支链(C1～C6)烷基，杂环直链或支链(C1～C6)烷基，R4所代表的基团选自(CH2)nR5，其中R5代表的基团选自氨基直链或支链(C1～C6)烷基、取代氨基直链或支链(C1～C6)烷基，单胍基直链或支链(C1～C6)烷基，二胍基直链或支链(C1～C6)烷基，n是1～4的整数，(CH2)nNHR5，(CH2)nOR5，(CH2)nSR5，(CH2)nCOR5和(CH2)nCONHR5其中的R5是如上定义的，Ra和Rb可以相同或不同，彼此独立的所代表的基团选自氢，直链或支链(C1～C6)烷基、氨基、直链或支链烷基(C1～C6)氨基、芳基、杂环、芳胺基、杂环胺基......所有化合物及其在药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐，毫无疑问--“芳基”可被理解为苯基、萘基、四氢萘基、二氢萘基、茚基或2，3-二氢茚基，各自任选的被一个或多个相同或不同的基团取代，取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基，直链或支链(C1～C6)烷基、直链或支链(C1～C6)烷氧基、氨基、直链或支链氨基(C1～C6)烷基，--其中各烷氧基部分可以是直链或支链的--，直链或支链(C1～C6)酰基、直链或支链(C1～C6)烷氧基羰基，直链或支链(C1～C6)烷基氨基羰基和氧代--“杂环”被理解为饱和或不饱和的单-或-二环基团，具有芳族和非芳族特征，具有5至12个环原子，含有一个、两个或三个相同或不同的杂原子，杂原子选自氧、氮、硫，杂环被理解为可以任选的被一个或多个相同或不同的取代基取代，取代基选自卤素、羟基、直链或支链(C1～C6)烷基、直链或支链(C1～C6)烷氧基、硝基、氧代和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1～C6)烷基取代)在杂环中，可以象征性而不加任何限制的提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃-4-酮、吡嗪基、嘧啶基、异噁唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、异喹啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基......在药学上可接受的酸中，可以不加限制的提到盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、甲磺酸、樟脑酸等在药学所接受的碱中，可以不加任何限制的提到氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、叔丁胺等按照一种有利的变例，优选的本发明化合物是，其中，R1是S(CH2)nCOR3，n＝1，其中R3是如式(I)定义的R4是(CH2)nCOR5，n＝1，其中R5是如式(II)定义的按照一种有利的变例，优选的取代基R1是CONR3aR3b其中当R3a代表氢原子时，R3b代表氨基(C1～C6)烷基，胍基(C1～C6)烷基优选取代基R4是(CH2)nCONR5aR5b其中当R5a代表氢原子时，R5b代表氨基(C1～C6)烷基，胍基(C1～C6)烷基按照本发明，优选的取代基R2是氢原子和胺基直链(C1～C6)烷基尤其有利的是R2代表氢原子和N，N-二甲基胺基丙基、N，N-二乙基胺基乙基按照本发明，优选的化合物是N-(2-氨基乙基)-2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)乙酰胺N-(3-氨基丙基)-2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)乙酰胺N-(2-氨基乙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺N-(3-氨基丙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺N-(2-氨基乙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(3-二甲基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺N-(3-氨基丙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(3-二甲基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺N-(2-氨基乙基)-2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)乙酰胺N-(3-氨基丙基)-2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)乙酰胺2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺2-[2-二乙基胺基-9-(3-二乙基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺2-[2-二乙基胺基-9-(3-二乙基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)-N-(2-胍基乙基)乙酰胺2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)-N-(3-胍基丙基)乙酰胺优选化合物以及它们与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐构成本发明完整内容的一部分本发明还涉及式(I)化合物和式(II)化合物的制备方法，其特征在于使用(III)化合物作为原料 其中，Ra、Rb是如上定义的按照有机合成常规的取代条件，与氨(胺)反应得到式(IV)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的按照有机合成中硝基还原的反应条件，将式(IV)中的硝基结构还原为氨基(胺基)，得到式(V)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的按照有机合成中的环合反应条件，使该式(V)化合物与二硫化碳反应得到式(VI)化合物；与酸和亚硝酸钠作用得到式(VII)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的按照有机合成中烷基化的反应条件，使式(VI)化合物和(VII)化合物分别与氯乙酸乙酯在碱催化下反应，分别得到式(VII)化合物和式(IX)化合物 其中Ra、Rb、R2是如上定义的按照常规的酰胺化条件，用式(X)化合物处理式(VII)化合物，用式(XI)化合物处理式(IX)化合物R3aNHR3b(X) R5aNHR5b(XI)其中R3a、R3b、R5a、R5b是如上定义的得到式(Ia)化合物，即式(I)化合物的一个特定例子和式(IIa)化合物，即式(II)化合物的一个特定例子 其中Ra、Rb、R2、R3a、R3b、R5a、R5b是如上定义的将式(Ia)化合物和式(IIa)化合物分别置于式(XII)化合物作用下 得到(Ib)化合物，即式(I)化合物的一个特定例子和式(II)化合物，即式(IIb)化合物的一个特定例子 其中Ra、Rb、R2、R3a、R5a是如上定义的化合物(Ia)和(IIa)、(Ib)和(IIb)构成本化合物的整体如果必要的话，这些化合物按照常规纯化工艺进行纯化，如果需要的话，可以任选的用药学上可以接受的酸或碱转化为加成盐式(III)、(X)、(XI)、(XII)化合物是商业上可以得到的化合物，或者是按照有机合成的已知方法得到的化合物本发明还涉及药物组合物，包含至少一种式(I)和式(II)化合物或与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐作为活性成分，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体在按照本发明的药物组合中，可以特别提到适用于口服、胃肠外(静脉内、肌肉或皮下)，经皮或透皮、经鼻、直肠、经眼或呼吸给药的那些，尤其是片剂或糖衣丸、舌下片、扁囊剂、胶囊剂、酊剂、栓剂、霜剂、软膏剂、皮肤凝胶、可注射或可饮用制剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂等本发明化合物具有抗HIV-1活性含有至少一种式(I)或式(II)化合物的药物组合因此可以用于爱滋病的治疗作为药物，由于剂量因患者年龄与体重、给药途径、疾病性质与严重性和所接受的任何其它治疗而异下列实施例阐述而绝非限制本发明所用原料和试剂是已知的产品，或者是按照已知操作制备的产品实施例和合成步骤中所述化合物的结构是按照常规的光谱技术(红外、NMR、EI质谱、FAB+--质谱......实施例1N-(2-氨基乙基)-2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)乙酰胺步骤AN2，N2-二乙基-6-甲基-5-硝基-嘧啶-2，4-二胺将2-N，N-二乙基胺基-4-氯-6-甲基-5-硝基-嘧啶1.0g以20ml无水乙醇溶解，加入26％的5ml浓氨水，常温搅拌12h，蒸除乙醇及过量氨水，水洗后干燥得预期产物步骤BN2，N2-二乙基-6-甲基-嘧啶-2，4，5-三胺将步骤A中得到的产物2.21g以30ml无水甲醇溶解，10％Pd/C 0.11g催化下常温常压加氢还原，反应24h后，滤除催化剂，蒸除溶剂，得预期产物步骤C2-N2，N2-二乙胺基-6-甲基嘌呤-8-硫酮将步骤B中的产物1.9g溶于20ml无水乙醇中，加入KOH 0.56g，搅拌下常温滴加二硫化碳0.5ml，滴加完毕后常温反应1h，加热回流5h蒸除乙醇，残余物以15ml水溶解，以15％的HCl调节pH＝3，生成大量白色固体，无水乙醇重结晶获得预期产物步骤D(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-)巯基乙酸乙酯将步骤C中的产物1.5g溶于含有氯乙酸乙酯1.16g，无水碳酸钾1.3g，碘化钾0.05g的50ml的四氢呋喃中，常温搅拌反应12h，滤除无机盐，滤液浓缩后柱层析得预期产物步骤EN-(2-氨基乙基)-2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)乙酰胺将步骤D中的产物5a 0.45g溶于10ml含有0.42g 1，2-乙二胺的无水甲醇中，氮气保护下回流8h减压蒸除溶剂和部分1，2-乙二胺，柱层析得预期产物淡黄色粘稠物FAB+MS3371H NMR3.49，3.44，3.23，2.67，2.43，1.10实施例2N-(3-氨基丙基)-2-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)乙酰胺操作步骤同实施例1，在步骤E中使用1，3-丙二胺作为反应物淡黄色粘稠物FAB+MS3511H NMR3.49，3.21，3.15，3.00，2.50，2.41，2.20，1.50，1.20，0.98实施例3N-(2-氨基乙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺操作步骤同实施例1，在步骤A中使用N，N-二乙基乙二胺作为反应物黄色油状物FAB+MS437.2(M+1)1H NMR8.59，4.06，3.83，3.62～3.69，3.29～3.35，2.75～2.82，2.63，2.56～2.63，1.10～1.27，实施例4N-(3-氨基丙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺操作步骤同实施例3，在步骤E中使用1，3-丙二胺作为反应物黄色油状物FAB+MS450.7(M+1)1H NMR8.57，4.03～4.08，3.82，3.66，3.30～3.37，2.60～2.79，2.55，2.52～2.58，1.56～1.65，1.00～1.20实施例5N-(2-氨基乙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(3-二甲基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺操作步骤同实施例1，在步骤A中使用N，N-二甲基-1，3-丙二胺作为反应物黄色油状物FAB+MS422.01H NMR8.54，4.04～4.09，3.84，3.66，3.29～3.35，2.78～2.82，2.57，2.32，2.24，1.93～1.98，1.20实施例6N-(3-氨基丙基)-2-[2-二乙基胺基-9-(3-二甲基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]乙酰胺操作步骤同实施例5，在步骤E中使用1，3-丙二胺作为反应物黄色油状物FAB+MS436.81H NMR4.03～4.08，3.83，.3.66，3.30～3.34，2.68～2.71，2.55，2.30～2.35，2.24，1.92～1.97，1.56～1.63，1.19实施例7N-(2-氨基乙基)-2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)乙酰胺步骤F5-二乙胺基-7-甲基-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶将1.1g N2，N2-二乙基-6-甲基-嘧啶-2，4，5-三胺溶于3ml 36％的乙酸中，在-5℃滴加2ml含0.45g亚硝酸钠的水溶液，后在35℃水浴下反应4h将反应混合物倾入100ml冷水中，将析出的固体过滤干燥，即得预期产物黄色晶体熔点169～171℃，EI-MS2061H NMR3.81，2.84，1.63，1.39步骤G(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-3-)-乙酸乙酯将步骤F中得到的产物0.8g溶于30ml含有0.6g氯乙酸乙酯、0.6g无水碳酸钾和0.05g碘化钾的丙酮中，回流反应8h，滤除无机盐后旋干溶剂，柱层析获得预期产物黄色晶体熔点90～92℃EI-MS2921H NMR5.21，4.24，3.72，2.80，1.33，1.21步骤HN-(2-氨基乙基)-2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)乙酰胺将步骤G中的产物0.5g溶于15ml含有0.52g乙二胺的无水乙醇中，氮气保护下加热回流8h，j减压蒸除溶剂和部分乙二胺，柱层析得预期产物白色固体熔点163～166℃EI-MS3061H NMR5.14，3.73，3.34，2.80，2.78，1.65，1.24实施例8N-(3-氨基丙基)-2-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)乙酰胺操作步骤同实施例7，在步骤G中使用1，3-丙二胺作为反应物白色固体熔点155～157℃EI-MS3201H NMR5.11，3.73，3.39，2.78，2.71实施例92-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺步骤I将0.15g三氧化硫脲一水合物在1h内于35℃下分批加入15ml溶有0.4g实施例1得到的化合物的无水乙醇中，在35～45℃保温反应2h，蒸出除溶剂，柱层析纯化浅黄色粘稠固体FAB+MS379.81H NMR4.10，3.90，3.32，3.20，2.62，1.02实施例102-(2-二乙基胺基-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基)-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例2得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS393.41H NMR3.48，3.08，3.20，2.63，2.43，1.50，1.20，1.01实施例112-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例3得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS479.1(M+1)1H NMR4.63，4.28，3.81，3.43，3.21～3.24，3.11～3.23，2.99～3.06，2.34，1.13，0.97，实施例122-[2-二乙基胺基-9-(2-二乙基胺基乙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例4得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS493.4(M+1)1H NMR4.59，3.76，3.28～3.33，3.12～3.17，3.00～3.10，2.41，1.40～1.70，1.13，1.00实施例132-[2-二乙基胺基-9-(3-二乙基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(2-胍基乙基)-乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例5得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS464.91H NMR4.26～4.31，3.61，3.46，3.18～3.29，3.01～3.07，2.68，2.40，2.16～2.21，0.99实施例142-[2-二乙基胺基-9-(3-二乙基胺基丙基)-6-甲基-9H-嘌呤-8-巯基]-N-(3-胍基丙基)-乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例6得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS477.81H NMR4.30，3.61，3.48，3.37，3.04～3.17，2.68，2.41，2.19，1.62，0.99实施例152-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)-N-(2-胍基乙基)乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例7得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS349.5(M+1)1H NMR5.10，3.48～3.56，3.55，3.10，2.53，1.08实施例162-(5-二乙基胺基-7-甲基-[1，2，3]三唑[4，5-d]并嘧啶-3-)-N-(3-胍基丙基)乙酰胺操作同实施例9，在步骤I中使用实施例8得到的化合物作为反应物浅黄色粘稠固体FAB+MS362.71H NMR5.10，3.50，3.17，2.99，2.56，1.64，1.01实施例18转录水平拮抗HIV-1 Tat TAR RNA的结合我们成功构建了两个质粒，一个是Tat基因表达质粒(plasmid I)，另一个是以HIV-1 LTR片段为启动子，含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的质粒(plasmid II)转染大肠杆菌后，经酶切鉴定得到阳性克隆利用磷酸钙介导这两种质粒共转染293 T细胞，24小时后加入3种样品，浓度为30μmol/L收集48小时培养上清液，用CAT ELISA试剂盒在405/490nm波长下检测上清液中的CAT活性考察样品对Tat-TAR相互作用的影响以未加样品plasmid I、II共转染体系的CAT活性为100％，用相对活性表示加样共转染体系的CAT活性实施例19抑制HIV-1复制体外实验采用MT4细胞与HIV IIIB株进行试验，使用的病毒量分别为100TCID50和1000TCID50(tissue cultured dose).MT4细胞和HIV IIIB株与不同剂量下的药物培养5天后，在显微镜下观察CPE(细胞病变---空泡、肿胀、融合等)设立五组实验对照药物+MT4细胞空白对照MT4细胞+HIV IIIB阴性对照水+MT4细胞+HIV IIIB阳性对照AZT+MT4细胞+HIV IIIB实验组药物+MT4细胞+HIV IIIB