专利名称：乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用的制作方法人膜岛素样生长因子-I(human Insulin-like growth factor-1, hIGF-1)是人体内一种重要的促生长因子，具有许多生理学活性及潜 的药用价值。近年来，hIGF-1在治疗临床疾病方面比较认可的适应症包括Laron侏儒综合征、糖尿病、胰岛素抵抗综合征等多种顽疾，并取得了良好的效果。因此其临床应用价值日益受到人们的重视，显示出巨大的应用潜力，hIGF-1的制备成为国内外研发的热点之一。现代分子生物学技术的发展使hIGF-1的大量获得成为可能，目前国际上已经有人利用基因重组技术生产制备hIGF-1并作为药物开发，美国Insmed公司使用原核大肠杆菌系统表达获得hIGF-1，商品名为美卡舍明一林菲培(Mecasermin Rinfabate),已获得FDA批准用于治疗严重原发性hIGF-1缺乏患儿。近年来国内关于hIGF-1体外表达的报道也不少，但大多为实验室规模的研究，从我国国家食品药品监督管理局网站检索得知，目前国内尚无单位申报hIGF-1新药。高密度细胞培养技术(high cell density cultivation, HCDC)即高密度发酵技术，是为大规模生产重组蛋白而发展起来的一门发酵工艺，与传统的发酵技术相比，该技术可以减少培养体积、缩短生产周期、减少设备投资等，从而达到降低生产成本、提高生产效率的目的，这为高效生产hIGF-1蛋白提供了新的思路。然而，国内公开报道的关于hIGF-1蛋白基因工程菌高密度发酵的工艺尤其是在诱导剂的使用上还存在一定不足与缺陷。在乳糖操纵子调控机理基础上设计和构建的表达系统常用的诱导剂是非代谢性乳糖类似物异丙基_ 0 -D-巯基半乳糖苷(isopropylthio- ^ -D-galactoside, IPTG),其诱导效率高，只需要少量即可对lacUV5与T71ac等强启动子产生持久的诱导作用，从而高效表达重组蛋白。然而，IPTG对人体有潜在毒性且价格昂贵，应用于基因工程新药工业化生产存在成本较高及产品中的IPTG残留可能造成人体损害等局限性，有些国家不提倡使用或甚至明文规定在工业化生产人重组蛋白质的过程中不得使用IPTG，因此IPTG在基因工程新药hIGF-1的工业化制备中的应用受到限制。目前国内公开报道的基于乳糖操纵子机理构建的工程菌高密度发酵表达hIGF-1使用的诱导剂均为IPTG，所以一般仅限于实验室研究水平，难以实现进一步的产业化大规模生产。要构建能够进一步实现产业化生产并且具有成药可能性的hIGF-1制备工艺，必须寻找在高密度发酵表达过程中能够代替IPTG的诱导剂。乳糖(lactose)是一种无毒、价格低廉的二糖，易溶于水，有多种存在形式，商品化的乳糖主要以a-单水化合物形式存在，又称为a-乳糖。作为原核细胞的常用碳源，乳糖对乳糖操纵子也具有天然的诱导作用，也可用于诱导宿主菌表达重组产物，但其诱导效率不如IPTG。近年来国内外均有学者尝试使用乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导外源蛋白在细菌中的表达，本课题组于国内首次公开报道使用乳糖诱导大肠杆菌在摇瓶水平表达hIGF-1 的研究[杨渐，俞昌喜，廖联明，廖虹婷.乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的 表达，海峡药学，2010，22 (8):248-252]，但乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中 作为诱导剂的应用未见文献报道。究其原因主要是乳糖本身可被细菌利用作为代谢能源， 使用乳糖作为诱导剂，其作用机制较为复杂，诱导条件不容易掌握，需要对诱导剂浓度、诱 导时机、诱导时间、添加方式等诱导条件进行探索研究后才能使其能够稳定高效诱导重组 大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1。
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种乳糖尤其是以a-单水化 合物形式存在的商品乳糖(即a-乳糖)乳糖在制备诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达 hIGF-1的诱导剂中的应用，即在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中作为诱导剂的使 用方法，包括乳糖诱导剂量、诱导时机、诱导时长、添加方式等，即乳糖作为诱导剂在重组大 肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是乳糖尤其是以a -单水化合物形式 存在的商品乳糖(即乳糖)作为诱导剂在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应 用，即乳糖在制备诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1的诱导剂中的应用。所述的乳糖是由半乳糖通过a-1，4-糖苷键连接葡萄糖而形成的二糖，其分子式 为C12H220n，结构式为本发明公开一种乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用，尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用。乳糖能够诱导基于乳糖操纵子原理构建的含有外源hIGF-1原核大肠杆菌表达系统高密度发酵表达hIGF-1，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析分子量符合设计理论值，蛋白质免疫印迹分析结果提示诱导产物具有人源性IGF-1抗原活性，表明乳糖可以在重组大肠杆菌的高密度发酵中作为诱导剂诱导hIGF-1的表达。其表达成本低，表达效率高，且乳糖本身对人体无毒，因此可为安全、无毒的hIGF-1制备工艺的建立奠定基础，使其产业化生产成为可能。