专利名称：用于枯萎病的生物防治剂及其制备和使用方法农作物枯萎病(Cucurbits Fusarium Wilt)又称蔓割病,萎蔫病,是作物类的一种重要土传病害，分布广泛，植株幼苗期与成株期均可发病，主要危害黄瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜等葫芦科作物，以及番茄、茄子、马铃薯等茄科作物。枯萎病是由半知镰刀菌属真菌侵染所致。经鉴定，我国有两个种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysorum Schlecht.)和瓜类镰刀菌(Fusarium bulbigenum Cke. et Mass. var. niveum(E. F. Sm) Wr.)。病菌的生活力极强， 在土壤中可存活5 6年。枯萎病是一类危害严重的土传病害。以黄瓜为例，每年发病率一般为12 30%，严重时可达80 90%，其中大棚栽培瓜类枯萎病的发病率较高，对生产造成的损失严重。对枯萎病的防治目前主要通过选种抗病品种、结合栽培管理、化学药剂防治等综合措施。化学药剂防治，主要采用药剂种子消毒和土壤药剂处理的方法。化学药剂的长期频繁使用，会引起病原菌抗药性的产生，导致防治效果不理想，且农产品农药残留超标和有害生物的猖獗，还造成环境污染，生态失衡等严重社会问题。生物防治是一种有效的作物病害防治途径，目前作物枯萎病的生物防治菌剂以细菌为主，防治稳定性差，加之枯萎病菌变异性强，容易产生抗病性，导致生物防治的实际应用受到较大限制。经检索，该领域的相关专利有1)中国专利申请(200710156836. O)公开了一种防治蔬菜真菌病害的微生物农药的制备方法。该方法利用土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌D，将其代谢产物与农药配合进行黄瓜枯萎病和番茄灰霉病防治，其使用方法没有完全脱离化学农药。2)中国专利申请(200810224678. 2)公开了一种防治植物真菌病害的菌剂，该菌剂主要由两种木霉组成。3)中国专利申请(200810011342)公开了采用一种海洋枯草芽孢杆菌发酵制剂防治黄瓜枯萎病。以上两个专利中所采用的菌种都比较单一，难以满足复杂的土壤环境要求，制剂的环境适应性和防效稳定性受到限制，对病害的防治作用有限。4)中国专利申请(201010277116. I) 一种防黄瓜枯萎病的微生物复合菌剂及其制备方法，其应用沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、植物乳杆菌和酿酒酵母组成的微生物复合菌剂防治黄瓜枯萎病。该专利公开的复合菌剂的制备方法采用多菌种混合发酵，由于每种菌的培养条件存在较大差异，致使终产品中每种菌的有效活菌数无法明确，就不能使每种菌的功效得到发挥，产品的使用效果就会受限制；另外该复合菌剂仅针对黄瓜枯萎病的防治，使用范围有限。
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种用于枯萎病的生物防治剂及其制备和使用方法，所制备的生物防治剂不仅能提高枯萎病的防治效果和防治稳定性，增加土壤营养素含量，改善土壤微生态环境，提高作物生长抗病性，重要的是其施用不添加化学农药，不会造成农药残留和环境污染，是绿色环保的防治方法。本发明所提出的用于枯萎病的生物防治剂，是以生化黄腐酸液为基液，内含有产纤维素酶绿色木霉菌(Trichoderma viride) > I X 107cfu/mL ;黑曲霉菌(Aspergillusniger) > 0. 5X 107cfu/mL ;枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) > 0. 8X 109cfu/mL ;胶质芽抱杆菌(Bacillus mucilaginosus) ^ 0. 8X 109cfu/mLo本发明生物防治剂的特点还在于，是以生化黄腐酸液为基液，按体积比加入其余组分产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液10% 20% ;黑曲霉菌菌悬液5% 10% ;枯草芽孢 杆菌菌悬液8% 15% ;胶质芽孢杆菌菌悬液8% 12% ;其中，产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液中活菌数> 108cfu/mL，黑曲霉菌菌悬液中活菌数> 108cfu/mL，枯草芽孢杆菌菌悬液中活菌数彡101Qcfu/mL，胶质芽孢杆菌菌悬液中活菌数彡101QCfu/mL。上述生物防治剂的制备方法，是将产纤维素酶绿色木霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌按常规方法分别扩大培养，再将培养液按10% 15%的体积量接种入发酵罐分别进行液体培养，培养温度25 35°C,培养时间24 72h,分别获得四种菌悬液；生化黄腐酸液可以按照中国专利申请(200610162041.6)中的方法制备，或是采用其他方法获得(如市购)；再将所述四种菌悬液按上述配比混合于生化黄腐酸液，搅拌均匀即可。本发明用于枯萎病的生物防治剂的使用方法包括三种方式种植前浸种将所述的生物防治剂加水稀释100 200倍，浸泡种子5 10小时；种植时灌根将所述的生物防治剂加水稀释100 300倍，按每亩4 5升生物防治剂的用量，浇灌于植株根部；植株喷洒在结果和果实膨大期，将所述的生物防治剂按每亩I 2升的用量，过滤后加水稀释20 60倍，喷洒于叶面、叶背、果实及幼茎；以上三种方式在种植过程中允许单一使用，或视病情组合使用。本发明的生物防治剂采用细菌与真菌的复合微生物进行枯萎病的生物防治，一方面利用绿色木霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌及其代谢产物对病原菌的拮抗作用，提高防病能力；另一方面利用有益微生物和生化黄腐酸具有活化土壤营养、促进作物根系生长、诱导提高抗病性的作用，从而提高作物枯萎病的防治效果。本发明的生物防治剂适用于黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦瓜、丝瓜等葫芦科作物枯萎病的防治，也适于番茄、茄子等茄科作物枯萎病的防治。与现有技术相比，本发明具有以下优点I、所选用的微生物菌种具有较强的土壤与环境适应能力，施用后，菌株可迅速在叶面、茎杆及土壤中定殖，有效改善土壤微生物菌群数量；2、所选用的微生物菌种之间具有良好的协同促生作用，能保证复合微生物菌剂的活菌数和稳定性，提高抗病防效能力；3、所选用的微生物菌种均对枯萎病原菌(半知菌镰孢霉真菌)具有高效拮抗作用，可有效防治枯萎病，使发病率低于10% ；4、所选用的生化黄腐酸(BFA)具有分子量小、活性基团高的特点，能模拟自然界腐植酸形成的环境，将多种微生物接种到作物生长环境，具有改良土壤、提高地温、促使根系发达、有效调节土壤酸碱度、解决土壤板结等方面的功效；在气候干燥情况下，有缩小作物气孔开张度的作用；5.本发明生物防治剂可以完全替代化学药剂，使用时无污染、无残留、无生态毒性，使作物增产15%以上。实施例I、按体积比，将产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液10%、黑曲霉菌菌悬液10%、枯草芽孢杆菌菌悬液8 %、胶质芽孢杆菌菌悬液10 %，生化黄腐酸液62 %，混合均匀，得到生物防治剂。以西瓜为实验对象，进行浸种和灌根试验将该生物防治剂加水稀释100倍，将西瓜种子用生防制剂稀释液浸泡5小时，种植。将该生物防治剂按每亩5升的用量，加水稀释100倍，在西瓜生长的抽蔓期和果实生长旺盛期，分两次浇灌于植株根部。效果采用本发明实验组的西瓜枯萎病发病率为5%，化学防治组的发病率为10%，未防治对照组的发病率为20% ;实验组比对照组的西瓜增产21%。实施例2、按体积比，将产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液15 %、黑曲霉菌菌悬液8 %、枯草芽孢杆菌菌悬液10%、胶质芽孢杆菌菌悬液12%，生化黄腐酸液55%，混合均匀，得到生物防治剂。以番茄为实验对象，进行浸种和喷洒试验将该生物防治剂加水稀释200倍，浸泡番茄种子8小时，种植。在番茄生长膨大期，将该生物防治剂按每亩I升的用量，加水稀释20倍，喷洒于叶面、叶背、果实及幼茎；喷洒2次，间隔I周。效果采用本发明实验组的番茄枯萎病发病率为8 %，化学防治组的发病率为15%，未防治对照组的发病率为22% ;实验组比对照组的番茄增产16%。实施例3、 按体积比，将产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液20 %、黑曲霉菌菌悬液5 %、枯草芽孢杆菌菌悬液15%、胶质芽孢杆菌菌悬液8%，生化黄腐酸液52%，混合均匀，得到生物防治剂。以黄瓜为实验对象，进行浸种、灌根和喷洒试验将该生物防治剂加水稀释150倍，浸泡黄瓜种子10小时，种植。在黄瓜生长定殖期，将该生物防治剂按每亩2升的用量，加水稀释200倍，浇灌于植株根部；在黄瓜生长蹲苗期，将该生物防治剂按每亩3升的用量，加水稀释200倍，浇灌于植株根部。在黄瓜结果盛瓜期，将该生物防治剂按每亩2升的用量，加水稀释40倍，喷洒于叶面、叶背、果实及幼茎；共喷洒3次，每次间隔I周。效果采用本发明实验组的黄瓜枯萎病发病率为5 %，化学防治组的发病率为14%，未防治对照组的发病率为35% ;实验组比对照组的黄瓜增产28%。实施例4、按体积比，将产纤维素酶绿色木霉菌菌悬液18 %、黑曲霉菌菌悬液I %、枯草芽孢杆菌菌悬液12%、胶质芽孢杆菌菌悬液10%，生化黄腐酸液53%，混合均匀，得到生物防治剂。以甜瓜为实验对象，进行浸种、灌根和喷洒试验将该生物防治剂加水稀释150倍，浸泡甜瓜种子8小时，种植。将该生物防治剂按每亩5升的用量，加水稀释200倍，在甜瓜生长的幼苗期和生蔓期，分两次浇灌于植株根部。在甜瓜结果膨大期，将该生物防治剂按每亩I. 5升的用量，加水稀释60倍，分别在结果前期和中期间隔I周各喷洒I次，喷洒于叶面、叶背、果实及幼茎。 效果采用本发明实验组的甜瓜枯萎病发病率为7%，化学防治组的发病率为12%，未防治对照组的发病率为22% ;实验组比对照组的甜瓜增产18%。

本发明公开了一种用于枯萎病的生物防治剂及其制备和使用方法，其是以生化黄腐酸液为基液内含有产纤维素酶绿色木霉菌≥1×107cfu/mL；黑曲霉菌≥0.5×107cfu/mL；枯草芽孢杆菌≥0.8×109cfu/mL；胶质芽孢杆菌≥0.8×109cfu/mL；所制备的生物防治剂对病原菌有拮抗作用，能提高防病能力；其施用具有活化土壤营养、促进作物根系生长、诱导提高抗病性的作用，从而提高作物枯萎病的防治效果，使发病率低于10％。本发明生物防治剂可以完全替代化学药剂，使用时无污染、无残留、无生态毒性，使作物增产15％以上；适用于黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦瓜、丝瓜等葫芦科作物，以及番茄、茄子等茄科作物的枯萎病防治。