专利名称：一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法香蕉枯萎病是分布于世界各主要香蕉产区的重要病害。由于香蕉枯萎病是典型的土传病害，其防治非常困难，应用抗病品种防治香蕉枯萎病是目前最经济有效的方法。目前，我国普遍使用的香蕉枯萎病抗病种苗鉴定一般采用以土壤、细砂或基质为载体的盆栽接种的方法，如应用最广泛的盆栽灌根法和浸根后移栽法等，上述盆栽接种方法主要存在以下问题1、由于土壤微生物的交互作用会影响试验结果的准确性，必须事先 进行大规模的土壤消毒，操作不便，不利于抗病种苗的大量筛选；2、鉴定周期长，通常鉴定一次需要30天以上；3、种苗与土壤接触可能遭受其他土传病害的干扰，影响试验结果的准确性。
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种通过在水培条件下对香蕉苗进行苗期接种，提高香蕉枯萎病育种的效率，同时为香蕉与病原菌互作机制、病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、植物抗病机制、抗病种质资源筛选及抗病品种选育等研究提供便利的快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法。本发明一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，通过如下步骤实现 (I)、建立香蕉苗水培系统 选取一定容积的水培容器，所述水培容器为水培箱、水培种植槽或水培池，水培容器内加入香蕉苗水培营养液，水培容器内嵌置有定植板，所述定植板为厚度2-3cm的轻质聚苯乙烯泡沫板，所述定植板上开设有若干直径为5-6 cm的开孔，开孔内匹配置放有培养杯，所述培养杯壁上开设有若干孔洞，所述培养杯内放置有香蕉苗；将培养杯置放于开孔内后，培养杯接触香蕉苗水培营养液深度为0. 5-2. Ocm,以避免香蕉苗整个球茎浸没入香蕉苗水培营养液中；所述水培容器通过管道连通有小型电动加氧泵，以用于提供香蕉苗水培营养液循环及加氧；电动加氧泵上设置有定时控制器，定时控制器控制电动加氧泵启动和关闭来调节香蕉苗水培营养液中含氧量。(2)、接种体制备及接种 制备浓度为105-108cfU/ml的香蕉枯萎病病原菌孢子悬浮液作为接种体，选取叶龄为5-12叶期，株高为8-35cm的健康组培香蕉苗；采用伤根浸菌液法进行接种，将组培香蕉苗自苗床拨出，用自来水冲洗干净，再分别浸在配制好的香蕉枯萎病病原菌孢子悬浮液中，以清水作对照，浸泡30-60 min后，将接种后的香蕉苗放置于培养杯内，并进行固定，移栽到盛有香蕉苗水培营养液的水培容器中；所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense),包括 4 号生理小种(Foc4)、I 号生理小种(Foci )、2号生理小种或大蕉枯萎病菌等。(3)、香蕉苗的日常管理 将接种后的香蕉苗置于温度为2(T32°C、光照的环境中进行观察，光照提供方式可为自然光或人造光，保持水培容器内的香蕉苗水培营养液每小时通电加氧10-20min，并定期对香蕉苗水培营养液进行补充，记录植株的生长情况。(4)、病情调查与分级 接种香蕉枯萎病病原菌大约10天后病症初显，开始按照病害评价等级对香蕉苗进行病害等级鉴定，记录香蕉苗的发病率及病情指数，每隔3-5天调查一次，共调查3-5次，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力。其中叶片病情调查方法为0级无症状；1级叶片黄化或萎蔫面积不超过叶片总 面积的50% ;2级叶片黄化或萎蔫面积超过叶片总面积的50% ;3级叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；4级整株枯死。同时，如仅对香蕉品种抗性进行鉴定不需保留抗性的香蕉苗，在最后一次调查时同时切开球茎调查球茎危害状况。其中球茎内部症状病情调查方法为0级球茎全部干净，维管束不变色；1级球茎全部干净，维管束有零星小点变色；2级维管束组织变色小于1/3 ；3级维管束组织变色在1/3至2/3之间；4级维管束组织变色大于2/3 ；5级维管束组织全部变色。本发明与现有技术比较具有以下有益效果
(1)能直接观察不同发病时期香蕉苗根系及假茎、球茎的变化情况，为香蕉枯萎病病原菌侵染过程及寄主与病原互作机制等研究提供便利；
(2)可在较短时间内连续鉴定较大数量的组培香蕉苗，有利于大规模筛选香蕉枯萎病抗病种苗；
(3)经鉴定为具有抗性的香蕉苗可不伤根系移栽至田间继续生长；
(4)采用香蕉苗水培营养液为香蕉苗提供生长载体，可减少其他土传病害的干扰，提高试验结果准确性；
(5)香蕉枯萎病抗病鉴定时容易进行人工控制，满足不同试验需要。综上所述，本发明一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，通过香蕉苗期接种及水培鉴定方法，在较小面积上连续鉴定大量组培香蕉苗，一年可进行多次鉴定，提高了试验结果的可靠性、缩短了鉴定周期、节省场地及试验成本；能有效排除土壤的结构、营养、微生物等物理化学生物性差异，病原菌量差异及其他病害对香蕉枯萎病抗病性鉴定的干扰。

与
对本发明作进一步详细描述。本发明一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，通过对巴西(感病品种)、农科I号(中抗品种)、抗枯5号(高抗品种)3个不同抗性的香蕉品种的抗病性鉴定中，并与田间病害评价进行对照。I.准备接种体。基于前期的致病力检测试验，采用致病力较强的供试致病菌株尖孢镰孢菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)。4号生理小种菌株接种于无菌马铃薯乳糖产孢子培养液中(马铃薯200g，乳糖20g，水IOOOmL, 121 °C高温灭菌20min)，在温度为25_28°C、转速为150r/min恒温条件下振荡培养5_7天后，4号生理小种菌液用无菌水配成浓度为106cfu/ml的香蕉枯萎病病原菌孢子悬浮液。2.选取叶龄为5-6叶期，株高约IOcm的健康组培香蕉苗。3.以容积为40cm X 30cm X 20cm的塑料箱作为水培容器，在水培容器上面置放厚为2 cm定植板,定植板上开有三行、每行两个直径为5. 5cm的开孔,开孔内放置装有香蕉苗的多孔洞培养杯，培养杯接触营养液的部分应有5-20_深。池外放置小型电动加氧泵用于营养液加氧，电动加氧泵接上定时器并接通电源，每小时通电加氧15min。4.营养液的配方参考刘士哲主编的《无土栽培技术》，采用香蕉沙培营养液配方，大量元素包括Ca(NO3)2.440400 mg/L、KN03200 mg/L、MgS04*7H20220mg/L、KH2PO4120mg/L、NH4N0350mg/L ;微量元素包括EDTA_2NaFe (含 Fe 14. 0%) 20_40mg/L、H3B032. 86mg/L、 MnSO4*4H202. 13mg/L、ZnSO4*7H200. 22 mg/L、CuSO4*5H200. 08mg/L、(NH4) 6Mo7024 . 4H20 0. 02mg/L，该配方一个剂量的EC值为I. 2ms/cm，调节培养液的PH至5. 8-6. O。5.选取巴西(感病品种，重病地发病率70%以上)、农科I号(中抗品种，重病地发病率20-40%)、抗枯5号(高抗品种，重病地发病率5%左右)3个不同抗性的香蕉品种，采用浸根后移栽法进行接种，将组培香蕉苗自苗床拨出，用自来水冲洗干净，剪除部分根系，保留根长2-3cm，再分别浸在配制好的香蕉枯萎病病原菌孢子悬浮液中，以清水做对照，浸泡30min后置放于多孔洞培养杯里面,移栽到盛有营养液的水培容器中，置于温度为25-28°C、自然光或人工光照的环境中观察发病情况，每3天观察并调查一次发病率及叶片病情指数。每个品种接种组培香蕉苗30株，做3次重复实验，每个品种均设置清水对照。鉴定结果如下
3个不同香蕉品种不同接种时期的发病情况


本发明公开了一种快速鉴定筛选香蕉枯萎病抗病种苗的方法，包括建立香蕉苗水培系统、接种体制备及接种、香蕉苗的日常管理、病情调查与分级等步骤，通过香蕉苗期接种及水培鉴定方法能有效控制在香蕉苗期接种鉴定过程中因土壤的结构、营养、微生物等差异造成的干扰，实现对抗香蕉枯萎病种苗快速、准确鉴定，能在较小面积上连续鉴定大量组培香蕉苗，一年进行多次鉴定，提高了试验结果的可靠性、缩短了鉴定周期、节省场地及试验成本。