专利名称：高效表达和高抗病毒活性的猪α干扰素基因及其表达蛋白的用途的制作方法干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。IFN可分为两个型(I型和II型)，IFN-α属于I型干扰素，是机体细胞抵抗病毒感染的第一道防线， 具有三大功能抗病毒作用、抗肿瘤作用和免疫调节作用。Lefevre等1990年首先克隆了猪 IFN-α (pIFN-α )基因并将其成熟蛋白基因在大肠杆菌中表达，具有较强的抗病毒活性。 随后国内外学者用腺病毒、大肠杆菌、酵母等表达了 pIFN-α，对其生物学活性进行了大量研究。本课题组也曾将PlFN-α克隆入真核表达载体pVAXl°，转染ΗΕΚ493Α细胞后表达的 PIFN-α 活性较低，仅为 lX106_°U/0. ImL0猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，俗称〃猪蓝耳病"，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。
为了解决以上问题，本发明提供了一种高效表达和高抗病毒活性的，特别是能有效抑制高致病性PRRSV的猪α干扰素基因。本发明还提供了所述猪α干扰素基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。本发明还提供了所述猪α干扰素基因的制备方法。本发明还提供了所述猪α干扰素基因表达蛋白的用途。本发明是通过以下措施实现的一种高效表达和高抗病毒活性的猪α干扰素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所7J ο一种序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。一种所述的猪α干扰素基因的合成方法，包括以下步骤 1、将真核质粒PVAX1°改造为pMVAXl° 由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和feoRI酶切位点，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将此段基因序列通过Ai酶切位点插入pVAXl°载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV ^oRI双酶切阳性克隆，命名为pMVAXl° ；所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 启动子序列为5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 2、构建表达pIFN-α的重组真核质粒pMVAXl°-pIFN-a 2. 1设计一对扩增pIFN-a成熟蛋白的基因序列的特异性引物，引物序列如下 pIFN-a -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3，， pIFN-a -Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’， 在上游引物pIFN-a -Fwd的5’端引入限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pIFN-a -Rev的5’端引入损ol限制性内切酶位点；2. 2从猪的脾或血淋巴细胞提取RNA，经反转录后得到cDNA，采用RT-PCR技术扩增出 pIFN-a的成熟蛋白基因的PCR产物；
2. 3用feoRI/IAoI双酶切pMVAXl°，胶回收得包含序列1的载体基因片段1，ρIFN- a 的成熟蛋白基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pIFN-a成熟蛋白的基因片段2，将载体基因片段1和基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行^01 1/损01双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得 pMVAXl°-pIFN- α，真核质粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步骤2.2 中 PCR反应体系为 25μ 中，含 cDNA lPL，Mg2+ 1. 5mmol/L,dNTP 200Mmol/ L, IOXLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFNa -Fwd 和 pIFNa -Rev 浓度均为 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反应条件为预变性95°C 5min，然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s，62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。步骤2. 2中RNA的提取步骤如下无菌采集猪的脾脏或血液，用淋巴细胞分离液分离脾或者血液淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含(X)2 5v%的环境中培养lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h，用TRIzol试剂提取总RNA。一种所述的猪α干扰素基因的表达蛋白在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。本发明的有益效果是
(1)用改造过的真核质粒？￥4乂1°即？1^々乂1°表达？0^-(1成熟蛋白基因，突破了通过 pVAXl°载体表达pIFN-α过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性；
(2)体外抗病毒试验证明，本发明构建的pIFN-α表达活性很高，转染Wg pMVAXl°-pIFN- α至ΗΕΚ493Α细胞的裂解物，用VSV检测IFN的活性单位高达 2X 107 0U/0. ImL,当活性在IOOU以上时能够明显抑制高致病性PRRSV在Marc_145细胞上的增殖，专用于对高致病性PRRSV等病毒性疾病的预防治疗及减少猪场的经济损失。


图1为本发明改造真核质粒pVAXl°为pMVAXl°及克隆pIFN-α成熟蛋白基因入 PMVAXl0的示意图，
图2为本发明重组质粒pMVAXl°5^I/^boRI双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2，000 DNA Marker,
41为重组阳性质粒pMVAXl°的5^1/^boRI双酶切结果，
图3为本发明重组质粒pMVAXl°-pIFN-a的feoRI/ZAoI双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2，000 DNA Marker,
1和2为两个不同重组阳性质粒pMVAXl°-pIFN-a的双酶切结果。

对本发明的猪α干扰素基因进行进一步说明。.将真核质粒pVAXl°改造为pMVAXl° 1.1插入基因的人工合成
参考GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882), 在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入Τ7启动子序列和feoRI酶切位点，将这段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，具体编码的包含Rabbit β -Globin Intron II基因的核苷酸序列见序列表中序列1，并克隆入T载体。所述pCMV 即刻早期启动子的一段序列为 5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACG CCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’，
所述 T7 启动子序列为 5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 1. 2 pMVAXf的构建及鉴定
从T载体上5^1/^boRI双酶切目的基因并胶回收，与同样经过Ai双酶切的
真核质粒pVAXl°并胶回收的载体片段在16°C过夜连接，转化DH5ci感受态细菌，37°C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37°C过夜振荡培养，第二天提取质粒， 进行双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒命名为pMVAXl°，交由TaKaRa公司测序，插入的基因片段序列与序列表中序列1相吻合。. pIFN-α成熟蛋白的基因克隆入pMVAXl° 2.1引物的设计及合成
根据GenBank公布的pIFN-α的基因序列(GenBank no. )(57191)，设计一对扩增 ρIFN- α成熟蛋白的基因序列的特异性引物，在上游引物ρIFN- α -Fwd的5 ’端引入限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pIFN-α -Rev的5’端引入损ol限制性内切酶位点，引物序列如下
ρIFN-α -Fwd 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3 ’ ρIFN- α -Rev: 5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。两条引物pIFN- α -Fwd和pIFN- α -Rev横跨pIFN- α成熟蛋白编码区，预计扩增片段长度为540bp左右，引物由TaKaRa公司合成。2. 2猪脾淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取
无菌采集约克猪的脾脏或者外周血，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞或外周血淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C、含(X)2 5v%的培养箱中培养lh，然后加入500μβ/ mL的植物血凝素(PHA)刺激1 后，用TRIzol试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板。2. 3 RT-PCR 扩增
以RNA经反转录酶Oligo cKT)反转录得到的cDNA为模板，pIFN- α -Fwd和 pIFN-α -Rev 为引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 25μ ，含 cDNA Ιμ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ ，pIFN α-Fwd 禾口 pIFN α-Rev 的浓度均为 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U。反应条件为预变性95°C 5min ；然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收获得PIFN- α成熟蛋白基因的PCR产物。2. 4重组真核表达质粒的构建及鉴定
用feoRI/ZAoI双酶切pMVAXl°，胶回收得到包含序列1的载体基因片段1，ρIFN-α的成熟蛋白基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pIFN-α成熟蛋白的基因片段2，将载体基因片段1和基因片段2连接，转化DH5 α感受态细菌，37°C过夜培养16h。 挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37°C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行feoRI/ 炀ol双酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒pMVAXl°-pIFN-a交由TaKaRa公司测序。用Vector NTI和DNAMar软件分析所插入的基因序列和推导氨基酸序列，真核质粒pVAXl°中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推导氨基酸序列如序列表中序列3所示。重组真核质粒表达的pIFN-α的抗病毒活性测定
3.1重组质粒pMVAXl°-pIFN-a转染人胚肾上皮细胞HEK493A 实验组具体操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)说明书进行。转染在6孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化ΗΕΚ493Α细胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素) 稀释细胞，使其密度达到2. 5 X IO5个细胞/mL，在6孔细胞板上每孔接种2. 5mL,于37°C、含 C025v%的培养箱中培养。在灭菌的1. 5mL的离心管中先加入500μ 37°C预热的OPTI-MEM 无血清培养基，然后加入l.opg的重组质粒pMVAXl°-pIFN-a，轻轻混勻；在另一个灭菌的1. 5mL的离心管中先加入500μ 37°C预热的OPTI-MEM无血清培养基，然后加入2. 5μ Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混勻，在室温放置5min ；然后将两个1. 5mL的离心管中的液体混勻在一起，室温放置20min ；从(X)2培养箱中取出细胞板，弃去上清，把液体混合物轻轻加入到细胞面上，然后立即把细胞板放入CO2培养箱中；温育他后，吸掉上清，轻轻加入2. OmL 37°C预热的10%的胎牛血清DMEM，放入(X)2培养箱继续培养Mh，然后反复冻融细胞转染物2次，12000rpm离心5min，得冻融裂解上清，待检。对照组1 将实验组的pMVAXl°-pIFN- α替换为空载体质粒pMVAXl°，其余方法同实验组一致，作为对照。对照组2 将实验组的pMVAXl°-pIFN- α替换为pVAXl°-pIFN_ α，其余方法同实验组一致，作为对照。所述pVAXl°-pIFN-a为真核质粒载体pVAXl°中只插入pIFN_a基因，而不插入 Rabbit β -Globin Intron II 基因。3. 2重组质粒pMVAXl°-pIFN- α表达的pIFN- α抗水泡性口炎病毒VSV活性检测向生长于96孔板上的Marc-145细胞单层分别加入上述实验组、对照组1和对照组2
得到的倍比维持液稀释的冻融裂解上清，每个稀释度4个孔，于37°C作用Mh，吸去上清，每孔接种IOOTCID5ci的VSV，于37°C、含0)25ν%的培养箱中培养。对_3他观察各孔细胞病变， 以能抑制50%细胞病变的样品的最高稀释度定义为IFN的1个活性单位(1U)。经检测，实验组1. 0μδ的重组质粒pMVAXl°-pIFN- α转染ΗΕΚ493Α细胞后的裂解上清中，IFN的活性单位高达2 X 107_ °U/0. ImL ；而对照组1空载体质粒pMVAX 1°转染ΗΕΚ493Α细胞后的裂解上清无抗VSV活性；对照组2载体质粒pVAXl°-pIFN_ α转染
6HEK493A细胞后的裂解上清中，IFN的活性单位只有lX106_°U/0. lmL。因此，重组质粒
pMVAXl°-pIFN- α 表达的 pIFN-α 活性相比 pVAXl°-pIFN_ α 提高了 20 倍。 3. 3重组质粒pMVAXl°-pIFN- α表达的pIFN- α抗高致病性PRRSV活性检测
向生长于96孔板上的Marc-145细胞单层分别分组加入上述实验组、对照组1和对照组2得到的倍比维持液稀释的冻融裂解上清，每个稀释度4个孔，于37°C作用Mh，吸去上清，每孔接种IOOTCID5ci的高致病性PRRSV，于37°C含C025v%的培养箱中培养。3天后，观察细胞病变情况，对照组1空载体PMVAXf细胞均产生明显的细胞病变；对照组 2 pVAXl°-pIFN-a在稀释度为1 104_°以下，而pMVAXl°-pIFN_ α实验组在稀释度为1: 2X105_°以下时(稀释度1: 2X105_°即为100U)，均无细胞病变。说明本发明重组质粒 pMVAXl°-pIFN- α表达的pIFN_a具有很强的抗高致病性PRRSV的作用。pIFN_a的量为 100U (稀释度1: 2X105_°即为100U)以上时，对IOOTCID5q的高致病性PRRSV具有明显的抑制效果，可以应用于制备治疗高致病性PRRSV的药物中。


本发明涉及基因表达领域。高效表达和高抗病毒活性的猪α干扰素基因核苷酸序列见序列2。序列2的基因克隆至真核表达载体获得的重组质粒。猪α干扰素基因合成方法将Rabbitβ-GlobinIntronII、pCMV即刻早期启动子和T7启动子插入pVAX1 ，得到pMVAX1 ；将pIFN-α的成熟蛋白基因插入pMVAX1 ，得到pMVAX1 -pIFN-α。猪α干扰素基因表达蛋白应用在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中。突破了通过pVAX1 载体表达pIFN-α时表达量低和活性差的局限性，活性单位达2×107.0U/0.1mL，能够明显抑制高致病性PRRSV增殖，减少猪场经济损失。