专利名称：一种利用香蕉叶生产的高产草菇菌株的制作方法草燕学名Ko7rarii 77a voIvacea (Bull, ex Fr.) Sing,另丨」名兰花燕、美味荀脚燕、中国蘑菇、南华菇，是世界四大栽培食用菌之一，也是我国广东地区的食用菌主打品种之一。其子实体肉质肥嫩、味道鲜美，且富含容易被人体吸收利用的优质蛋白质、不饱和脂肪酸、碳水化合物、多种维生素和矿物元素。草菇喜温、喜湿，夏季生长于稻草等禾本科草类或棉、麻等纤维废料上的草质腐生菌。草菇的生产目前主要原料是废棉和稻草。但是随着原材料的紧缺，这些原本不值钱的材料也价格上涨，导致了草菇生产成本的提高，抑制了菇农的种植草菇的积极性。香蕉叶是香蕉收获后产生的废弃物，含有丰富的纤维等物质。据不完全统计，我国每年约有2325.05万吨的香蕉废物被遗弃。目前人们尝试着对香蕉叶等废物进行综合开发利用的研究，如在堆制有机肥料、开发新型饲料和造纸等方面取得一定的进展，但在实际应用上还没有取得突破。另外也有利用香蕉废物进行栽培食用菌的报道，如在香蕉园行间栽培平菇；利用蕉叶代替稻草栽培草菇；以棉籽壳、香蕉茎叶为主料制作草菇菌种等。但由于现有菌种在香蕉废物上的适应性较差，生物学较低(低于10%)而至今没有得到推广应用。因此，目前还没有一种能够利用香蕉叶生产草菇的实用的高产菌株。
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用香蕉叶生产的高产草菇菌株。本发明具体是这样实现的: (1)野生草菇菌株的分离 在广东省湛江地区，5月至9月份期间，选择雨天第二天，对香蕉园进行野生草菇资源的调查。2009年7月4日，本发明人在广东海洋大学香蕉园中发现一个草菇子实体(说明书附图1)，该子实体发生于两株香蕉假茎之间的枯死叶鞘上。当天把它采集回，采用子实体组织分离法，无菌操作下，将子实体的菌盖去除，菌柄纵向撕成两半，用镊子镊取菌柄内部接近菌盖部位的菌肉，接于PDA平板上，保鲜薄膜密封后置于30°C的恒温培养。3天后，获得一株纯的菌丝体培养物，编号为Vb (说明书附图2)。该菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 2012115 ;中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的地址:湖北省武汉市武昌珞珈山； (2)菌株Vb子实体形态特征 对菌株Vb子实体的菌盖、菌柄、菌褶、菌托等的大小厚度颜色形状进行测量。采用配置Nikon显微镜观测担孢子的形态及大小，并拍照。其特征表现为:菌盖灰褐色，光滑干燥、中部较暗，直径3.5cm;菌肉白色，松软；菌褶肉桂色，稍密、平行、等长；菌柄白色中生，下宽上细、表面光滑、实心、内部松软、无菌环，长度2 cm;菌托灰褐色，杯状，非常薄，宽大，整齐。侧缘囊状体梭形，丰富，褶间囊状体棒状。担子棒状，着生4个担孢子。担孢子8.2-5.4X3.5-5.5Mm，卵形，光滑，顶端具萌发孔(说明书附图3)。孢子印粉红色肉桂。以上的形态特征与Singer (1951)和Chang (1965)报道的草燕形态特征一致；
(3)菌株Vb分子特征
直接用无菌牙签挑取PDA上培养的菌丝体，参考Ward et al.(2005)方法进行DNA的提取。得到的DNA加入70%乙醇清洗，晾干。将风干的DNA溶于100微升双蒸水中，存于4°C冰箱备用。使用通用引物ITSl和ITS4，聚合酶链式反应体系(25微升)包括:10倍聚合酶链式反应缓冲剂(含二价镁离子)2.5微升、脱氧核糖核苷三磷酸(2.5微摩尔/升)I微升、模板DNA(约30纳克)I微升、引物ITSl (5微摩尔/升)和ITS4(5微摩尔/升)各I微升、Taqmk聚合酶(5单位/微升)0.5微升、双蒸水18微升。聚合酶链式反应扩增程序为:94 °C预变性2分钟，94 V 30秒、55 V 30秒、72 V I分钟，35个循环，72
V10分钟，4 °C保存。PCR产物经纯化、回收后，送华大生物工程技术服务有限公司进行测序。将获得的序列在NCBI上进行Blast比对，并选取同源性较高和形态相近菌株序列用MEGA v4.0中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树,并用bootstrap对系统发育树进行检验，I 000次重复。其特征表现为；其ITS扩增产物的序列为721bp。经正反双向测序结果验证，双向测序结果基本一致。利用Blast比对结果表明，菌株Vb与K voIvacea(FT379273.1, FT379274.1, FT379272.1 等)同源件都为 100%。讲一步采用 MEGA4软件，采用邻近相邻法构建系统发育树，结果表明，菌株Vb与V.vo I vacea处在同一发育枝上,而与同属的其他种有较大的遗传差距(说明书附图4)。因此，结合形态特征，菌株Vb鉴定为草菇(Volvariella vo I vacea Vb 该成果已发表于 Scientia HorticulturaeCLiu Yue-Lian.2011.1dentification and cultivation of a wild mushroom from banana pseudo-stemsheath.Scientia Horticulturae, 129:922 - 925)，得到了国际同行的认可。(4)菌株Vb生物学特性 A、最适碳源
以蛋白胨0.3%，琼脂2.0%为基础培养基，分别添加葡萄糖2%、蔗糖2%、麦芽糖2%、乳糖2%、可溶性淀粉2%为处理，以不添加碳源为对照。培养基灭菌后制成平板，接种入活化的菌种5.0 mm2,置于30°C恒温培养，第三天每24小时观察记录一次，当有任一处理菌丝长满培养皿时即结束记录。按照菌丝生长速度(cm/d)=菌落直径(cm) /菌丝生长天数(d)公式来计算菌丝生长平均速度。每种配方3次重复。试验结果表明，菌株Vb菌丝生长速度最快的为鹿糖，为1.92cm/d,比对照提高30.61%，与可溶性淀粉组没显著差异，在5%水平上与葡萄糖组有显著差异。因此蔗糖为菌株Vb菌丝生长的最佳碳源。B、最适氮源
以葡萄糖2.0%，琼脂2.0%为基础培养基，分别添加酵母膏0.3%、蛋白胨0.3%、牛肉膏
0.3%,NH4NO30.3%、(NH4)2SO40.3%为处理，以不添加氮源为对照。结果显示，以蛋白胨和牛肉膏为氮源的菌丝长势强、生长速度快，两者没显著差异，生长速度相当。选择生长速度略快的牛肉膏为最佳N源 ，菌丝生长速度达1.67cm/d,比CK提高70.06%。C、最适 pH 值选择蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源，调节pH值为5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,9.0、10.0共
8个梯度进行试验，每种处理3次重复。接种后置于30°C恒温培养。结果表明，PH7.0、PH7.5和pH8.0时菌丝的生长速度最快，与其他处理有显著性的差异；即菌株菌丝适宜在中性偏碱的环境中生长，过酸或过碱的环境对菌丝生长不利。D、最适温度
选择蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源、pH值为7.5配成培养基，设置20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C共6个温度梯度进行试验。结果表明，30°C和35°C下菌丝生长速度最快，与其他设置的温度有显著差异。其次是25°C和20°C，与40°C和45°C下的菌丝生长速度有显著差异。因此该菌株为高温型菌。E、最适自然基质培养料
麦麸10%、含水量65%为基础，分别用90%的香蕉莖、香蕉叶、园林草、稻草、甘蔗渣、棉籽壳和杂木屑作为培养主要原料。试验结果表明，自然基质培养基中香蕉叶培养基与稻草培养基效果最好，菌丝生长速度最快，与其他处理有显著差异。园林草、棉籽壳、香蕉茎和蔗渣之间差异不显著，但与杂木屑显著性差异。该菌株在自然基质培养基中菌丝生长速度从快到慢的顺序为:香蕉叶 > 稻草 > 园林草 > 棉籽壳 > 香蕉茎 > 甘蔗渣 > 杂木屑。(5)菌株Vb子实体产生的最适培养料
分别使用香蕉叶、稻草、甘蔗渣、棉籽壳为培养料，每批培养料2.5 kg，三级菌种2 kg，3次重复，随机排列。用5%的石灰水分别浸泡不同的基质超过24小时，捞出，将吸水充分的材料浙去多余的水；一层料一层菌种地进行铺料播种，共铺料3层。在最后一层铺料上，撒满菌种，最后覆膜。发菌7-8天，第8-9天，采菇。测试结果表明，以香蕉叶栽培草菇所获得的产量或生物转化率最高，达24.17%，稻草的其次，为23.42%，甘蔗渣有17.03%,棉籽壳的最低，只有14.58% (说明书附·图5)。按照中国专利法和其实施细则的规定，本发明的草菇菌株Vb已于2012年4月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 2012115。草菇菌株Vb培养方法简单，材料来源丰富，对香蕉叶、稻草、甘蔗渣等材料有较强的分解能力，并且有较高的生物学效率，在生产上有良好的稳定性。这些特点对于实现对香蕉等废弃资源的充分利用，缓解原材料紧缺压力、保护环境、提高农田肥力，提高农民收入，丰富菜蓝子，具有积极的现实意义。


图1为野生草菇菌株Vb子实体；
图2为菌株Vb纯菌丝体；
图3为菌株Vb的担子及担孢子形态；
图4为菌株Vb系统发育树；
图5为菌株Vb利用香蕉叶生产的草菇。

实施例1
(1)野生草菇菌株的分离
在广东省湛江地区，5月至9月份期间，选择雨天第二天，对香蕉园进行野生草菇资源的调查。2009年7月4日，本发明人在广东海洋大学香蕉园中发现一个草菇子实体(说明书附图1)，该子实体发生于两株香蕉假茎之间的枯死叶鞘上。当天把它采集回，采用子实体组织分离法，无菌操作下，将子实体的菌盖去除，菌柄纵向撕成两半，用镊子镊取菌柄内部接近菌盖部位的菌肉，接于PDA平板上，保鲜薄膜密封后置于30°C的恒温培养。3天后，获得一株纯的菌丝体培养物，编号为Vb (说明书附图2)。该菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为 CCTCC M 2012115 ；
(2)菌株Vb子实体形态特征
对菌株Vb子实体的菌盖、菌柄、菌褶、菌托等的大小厚度颜色形状进行测量。采用配置Nikon显微镜观测担孢子的形态及大小，并拍照。其特征表现为:菌盖灰褐色，光滑干燥、中部较暗，直径3.5cm;菌肉白色，松软；菌褶肉桂色，稍密、平行、等长；菌柄白色中生，下宽上细、表面光滑、实心、内部松软、无菌环，长度2 cm;菌托灰褐色，杯状，非常薄，宽大，整齐。侧缘囊状体梭形，丰富，褶间囊状体棒状。担子棒状，着生4个担孢子。担孢子8.2-5.4X3.5-5.5Mm，卵形，光滑，顶端具萌发孔(说明书附图3)。孢子印粉红色肉桂。以上的形态特征与Singer (1951)和Chang (1965)报道的草燕形态特征一致；
(3)菌株Vb分子特征
直接用无菌牙签挑取PDA上培养的菌丝体，参考Ward et al.(2005)方法进行DNA的提取。得到的DNA加入70%乙醇清洗，晾干。将风干的DNA溶于100微升双蒸水中，存于4°C冰箱备用。使用通用引物ITSl和ITS4，聚合酶链式反应体系(25微升)包括:10倍聚合酶链式反应缓冲剂(含二价镁离子)2.5微升、脱氧核糖核苷三磷酸(2.5微摩尔/升)I微升、模板DNA (约30纳克)I微升、引物ITSl (5微摩尔/升)和ITS4(5微摩尔/升)各I微升、Taqmk聚合酶(5单位/微升)0.5微升、双蒸水18微升。聚合酶链式反应扩增程序为:94 °C预变性2分钟，94 V 30秒、55 V 30秒、72 V I分钟，35个循环，72
V10分钟，4 °C保存。PCR产物经纯化、回收后，送华大生物工程技术服务有限公司进行测序。将获得的序列在NCBI上进行Blast比对，并选取同源性较高和形态相近菌株序列用MEGA v4.0中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树,并用bootstrap对系统发育树进行检验，I 000次重复。其特征表现为；其ITS扩增产物的序列为721bp。经正反双向测序结果验证，双向测序结果基本一致。利用Blast比对结果表明，菌株Vb与K vo I vacea(FT379273.1, FT379274.1, FT379272.1 等)同源件都为 100%。讲一步采用 MEGA4软件，采用邻近相邻法构建系统发育树，结果表明，菌株Vb与V.vo I vacea处在同一发育枝上,而与同属的其他种有较大的遗传差距(说明书附图4)。因此，结合形态特征，菌株Vb鉴定为草菇(Volvariella vo I vacea Vb 该成果已发表于 Scientia HorticulturaeCLiu Yue-Lian.2011.1dentification and cultivation of a wild mushroom from banana pseudo-stemsheath.Scientia Horticulturae, 129:922 - 925)，得到了国际同行的认可。(4)菌株Vb生物学特性
A.最适碳源
以蛋白胨0.3%，琼脂2.0%为基础培养基，分别添加葡萄糖2%、蔗糖2%、麦芽糖2%、乳糖2%、可溶性淀粉2%为处理，以不添加碳源为对照。培养基灭菌后制成平板，接种入活化的菌种5.0 mm2,置于30°C恒温培养，第三天每24小时观察记录一次，当有任一处理菌丝长满培养皿时即结束记录。按照菌丝生长速度(cm/d)=菌落直径(cm) /菌丝生长天数(d)公式来计算菌丝生长平均速度。每种配方3次重复。试验结果表明，菌株Vb菌丝生长速度最快的为蔗糖，为1.92cm/d，比对照提高30.61%，与可溶性淀粉组没显著差异，在5%水平上与葡萄糖组有显著差异。因此蔗糖为菌株Vb菌丝生长的最佳碳源。B.最适氮源
以葡萄糖2.0%，琼脂2.0%为基础培养基，分别添加酵母膏0.3%、蛋白胨0.3%、牛肉膏
0.3%,NH4NO30.3%、(NH4)2SO40.3%为处理，以不添加氮源为对照。结果显示，以蛋白胨和牛肉膏为氮源的菌丝长势强、生长速度快，两者没显著差异，生长速度相当。选择生长速度略快的牛肉膏为最佳N源，菌丝生长速度达1.67cm/d,比CK提高70.06%。C.最适 pH 值
选择蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源，调节pH值为5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,9.0、10.0共8个梯度进行试验，每种处理3次重复。接种后置于30°C恒温培养。结果表明，PH7.0、PH7.5和pH8.0时菌丝的生长速度最快，与其他处理有显著性的差异；即菌株菌丝适宜在中性偏碱的环境中生长，过酸或过碱的环境对菌丝生长不利。D.最适温度
选择蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源、pH值为7.5配成培养基，设置20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C共6个温度梯度进行试验。结果表明，30°C和35°C下菌丝生长速度最快，与其他设置的温度有显著差异。其次是25°C和20°C，与40°C和45°C下的菌丝生长速度有显著差异。因此该菌株为高温型菌。E.最适自然基质培养料
以麦麸10%、含水量65%为基础，分别用90%的香蕉茎、香蕉叶、园林草、稻草、甘蔗渣、棉籽壳和杂木屑作为培养主要原料。试验结果表明，自然基质培养基中香蕉叶培养基与稻草培养基效果最好，菌丝生长速度最快，与其他处理有显著差异。园林草、棉籽壳、香蕉茎和蔗渣之间差异不显著，但与杂木屑显著性差异。该菌株在自然基质培养基中菌丝生长速度从快到慢的顺序为:香蕉叶 > 稻草 > 园林草 > 棉籽壳 > 香蕉茎 > 甘蔗渣 > 杂木屑。(5)菌株Vb子实体产生的最适培养料
分别使用香蕉叶、稻草、甘蔗渣、棉籽壳为培养料，每批培养料2.5 kg，三级菌种2 kg，3次重复，随机排列。用5%的石灰水分别浸泡不同的基质超过24小时，捞出，将吸水充分的材料浙去多余的水；一层料一层菌种地进行铺料播种，共铺料3层。在最后一层铺料上，撒满菌种，最后覆膜。 发菌7-8天，第8-9天，采菇。测试结果表明，以香蕉叶栽培草菇所获得的产量或生物转化率最高，达24.17%，稻草的其次，为23.42%，甘蔗渣有17.03%,棉籽壳的最低，只有14.58% (说明书附图5)。


本发明涉及一种利用香蕉叶生产的高产草菇菌株，该草菇菌株Vb已于2012年4月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M2012115；把发现的草菇菌株采集回，采用子实体组织分离法，无菌操作下，将子实体的菌盖去除，菌柄纵向撕成两半，用镊子镊取菌柄内部接近菌盖部位的菌肉，接于PDA平板上，保鲜薄膜密封后置于30℃的恒温培养，获得一株纯的菌丝体培养物，编号为Vb；草菇菌株Vb培养方法简单，材料来源丰富，对香蕉叶、稻草、甘蔗渣等材料有较强的分解能力，并且有较高的生物学效率，在生产上有良好的稳定性，对于实现对香蕉等废弃资源的充分利用，缓解原材料紧缺压力、保护环境、提高农田肥力，提高农民收入，具有积极的现实意义。