专利名称：内体Toll样受体活化的抑制的制作方法TLR是由富含亮氨酸的重复单位(Rpeat)的胞外域和胞内Toll/白介素-I (IL-I)受体(TIR)域组成的 I 型跨膜蛋白(Leulier 和 Lemaitre,Nat. Rev. Genet. 9 165-178 (2008)) o已经鉴别出十种人类TLR和十二种小鼠TLR。每种TLR都可以识别一种特定的分子模式。例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLRll与细菌外膜分子例如脂多糖(LPS)、肽聚糖和脂磷壁酸(lipoteic acid)结合，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别细菌、病毒甚至内源性核酸(Kawai 和 Akira, Semin. Immunol. 19 :24-32 (2007))。此外，TLR 可基于它们的细胞定位进行分类TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达在细胞表面上，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要(虽然不完全)定位于内体区室(Kawai和Akira, Semin. Immunol. 19 24-32(2007))。当病原体入侵宿主时，先天免疫细胞例如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞通过TLR识别病原相关分子模式(PAMP)和内源性损伤相关分子模式(DAMP)。TLR活化启动细胞内的信号事件(intracellular signaling event),该信号事件引起包括炎症和免疫调节细胞因子、趋化因子、免疫刺激受体在内的免疫应答基因的表达，其增强杀灭病原体并促使形成获得性免疫的过程(Takeda和Akira, Int. Immunol. 17 :1-14(2005)；Akira等，Cell 124:783-801(2006))。另一方面，TLR家族中某些成员的不适当活化会引起多种疾病的产生，包括细菌性败血症(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR9) (Wurfel等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178 :710-720 (2008) ；Knuefermann 等，Circulation 110 3693-3698(2004) ；Cavassani 等，J. Exp. Med. 205 =2609-2621 (2008) ；Alves-Filho 等，Crit. Care Med. 34 :461-470 (2006) ;Tsujimoto 等，J. H印atol. 45 :836-843 (2006))、非感染全身炎症反应综合征(TLR4) (Breslin等，Shock 29 :349-355 (2008))、多发性脑脊髓硬化症(TLR3、TLR4 和 TLR9) (Chen 等，Int. Immunopharmacol 7 :1271-1285 (2007))、全身性红斑狼疮(SLE) (TLR7 和 TLR9) (Marshak-Rothstein 和 Rifkin, Annu. Rev. Tmmuno1. 25 419-441 (2007))以及类风湿性关节炎(TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 和 TLR9) (Choe 等，J. Exp.Med. 197 :537-542(2003) ;0，Neil, Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 4 :319-327(2008))。此夕卜，临床前期研究和临床研究表明TLR活性的抑制对治疗特定疾病具有治疗效果。例如，在动物和临床研究中已经对各种LPS-中和剂和TLR4拮抗剂冶疗炎性疾病进行了评价(Leon等，Pharm. Res. 25 :1751-1761 (2008))。TLR9 抑制剂-一种抑制性 CpG DNA(Plitas 等，J. Exp. Med. 205 :1277-1283(2008))-和拮抗的抗-TLR3 抗体(Cavassani 等，J. Exp.Med. 205 =2609-2621(2008))提高了具有多微生物败血症的小鼠的存活率。寡核苷酸基TLR7和TLR9抑制剂防止了用来自SLE患者血清刺激的人类浆细胞树突状细胞产生IFNa (Barrat 等，J. Exp. Med. 202 :1131-1139 (2005))。但是，TLR 家族的冗余性可限制革巴向个别TLR抑制剂的效用。一经刺激，所有的TLR吸收细胞内含有TIR-域的衔接子，例如TRIF和MyD88 (Kawai 和 Akira, Semin. Immunol. 19 :24-32 (2007))。这些衔接子分子介导 TLR 相关信号的下游级联。TRIF被吸收至TLR3和TLR4并似乎活化IRF3、MAPK和NF- k B而MyD88与除了 TLR3以外的所有!1^有关，并且使1狀1(、11^5、11^7、獻 1(和即-1^8磷酸化，其能够增强I型IFN、炎性细胞因子和IFN-诱导基因的表达(Kawai和Akira，Semin. Immunol. 19 24-32(2007))。与其它TLR不同，内体TLR、TLR3、TLR 7、TLR8和TLR9都将微生物或宿主核酸分别识别为PAMP或DAMP。TLR信号通路的冗余性和相互联系性暗示其对抑制多种TLR的活性并同时有效地控制炎症和自身免疫反应以及增强TLR拮抗剂作为治疗剂的临床疗效很重要。最近发现，某些阳离子聚合物能够抵消多种寡核苷酸基药物(如，适配子)的活性，而不管它们的核苷酸序列(Oney 等，Control of Aptamer Activity by UniversalAntidotes An Approach to Safer Therapeutics, Nature Medicine (印刷中))。此夕卜，用环糊精基聚合物缩合的免疫刺激siRNA(—种TLR7激动剂)已经显示不会活化TLR7 (Hu-Lieskovan 等，Cancer Res. 65 :8984-8992 (2005))。本发明至少部分是设计用于检测以与序列无关的方式结合DNA和RNA的试剂(例如，结合核酸的阳离子聚合物)能否中和内体TLR配体并抑制相应TLR活化的研究的结果。
本发明一般而言涉及PRR，包括TLR(例如，内体TLR)。更具体而言，本发明涉及一种使用与核酸结合的试剂(“核酸结合剂”)优选以与能诱导TLR活化的核酸的核苷酸序列、化学物质(例如有或没有碱基或糖修饰的DNA或RNA)和/或结构(例如双链或单链的，与例如蛋白质复合或未复合的)无关的方式来抑制例如内体TLR的核酸诱导活化的方法。本发明还涉及使用此类核酸结合剂控制由核酸诱导受体(例如，内体TLR)活化引起的炎症和/或自体免疫反应的方法。本发明还涉及鉴别适合用于该方法的核酸结合剂的方法。根据后面的描述，本发明的目的和优点将会更加清楚。
图IA和图1B.阳离子聚合物抑制核酸诱导的TLR3和TLR9的活化。(图1A)用TLR9激动剂(CpG) (2iiM)、TLR3 激动剂(poly I:C) (10 u g/ml)或 TLR4 激动剂(LPS) (100ng/ml)和阳离子聚合物(⑶P、HDMBr、PAMAM、聚L-赖氨酸或鱼精蛋白(20 y g/ml)或PBS)在24-孔微板中培养小鼠巨噬细胞株Raw264. 7。使用未甲基化的GpC ODN作为CpG的阴性对照。培养18小时后，收集培养上清液并通过ELISA分析细胞因子。(图1B)使用FACS测试该经处理的细胞的共刺激分子CD86的表达。浅蓝色线表示PBS处理的细胞。绿色线和红色线分别表示GpC处理的细胞和CpG处理的细胞。数据表示三个独立的实验。误差棒为S. D. ；n =3. * P < 0.005 (TNF a 和 IL-6 ;CpG 或聚 I: C+阳离子聚合物 vsCpG 或单独的 Poly I:C)；JP = 0. 0169 和 0. 0395(分别为 TNFa 和 IL-6 ;聚 I: C+CDP vs 单独的 poly I:C) ;***P =0. 0256和0. 0281(分别为TNFa和IL-6 ;聚I :C+鱼精蛋白vs单独的poly I:C)。图2A和图2B.阳离子聚合物介导的TLR活化的抑制时间。(图2A)在24孔微板中用CpG(2 u M)培养细胞。在0、72、1、2、4、8或12小时时添加CDP(20 u g/ml)，随后添加CpG0在CpG处理24小时后，收集培养上清液并分析TNF a和IL-6的产生。(图2B)用⑶P或PBS预培养细胞I或2小时，用完全培养基洗涤三次，然后在添加有CpG的培养基中培养。同时用CpG和⑶P处理细胞作为对照。在CpG处理5小时后，用ELISA测定培养上清液中的 TNF a 的量。误差棒是 S. D. ；n = 3. * P < 0. 0001 (TNF a 和 IL-6 ;CpG+CDP vs 单独的CpG) ；J P = 0. 0230 和< 0. 0001 (分别是 TNF a 和 IL-6 ;CpG+CDP vs 单独的 CpG) ;_P =0. 0257 和 0. 0003 (分别是 TNF a 和 IL-6 ;CpG+CDP vs 单独的 CpG)。图3A和图3B.阳离子分子对TLR3和TLR9活化抑制的剂量依赖性。在存在或不存在指定浓度的CDP( □ )、HDMBr ( □)或PAMAM( ■)下用CpG(IyM)(图3A)或polyI:C(10ii g/ml)(图3B)培养IxlO6个Raw264. 7细胞。通过ELISA测定培养上清液中的TNF a和IL-6的量。误差棒是S. D. ；n = 3. NT :未测试。图4A 图4C.通过核酸结合聚合物可以缓解TLR3介导或TLR9介导的急性肝炎。(图4A)以腹腔注射(i.p.)给小鼠(5 10只小鼠/组)注入单独的D-GalN (20mg)、单独的CpG (51 u g)、D-GalN+GpC(51 u g)或 D-GalN+CpG (51 u g) 5 10 分钟后，给用 D-GalN+CpG挑战过的小鼠腹腔注射用药PBS (100 u I)、⑶P (200 u g ;蓝色菱形)、HDMBr (200或400 y g ;红色三角形)或PAMAM (200或400 ii g ;绿色长方形)。每天监测小鼠的存活率。(图4B)将Poly I:C(200ug)和D-GalN(20mg)在PBS (IOOiU)中的混合物腹腔注射注入小鼠(5只小鼠/组)。随后，腹腔注射PBS (100 ill ;黑圈)、CDP (400或800 ii g ;蓝色菱形)、HDMBr (200或400 ii g ;红色三角形)或PAMAM(200或400 y g ;绿色长方形)。注射间有5 10分钟的间隔。(图4C)给小鼠注射PBS、CpG+D-GalN或CpG+D-GalN+CDP。在注射16小时后，收集肝脏样品以进行组织学研究(苏木精和伊红染色)。有代表性的三个独立的结果，放大率X20。图5A 和图 5B. CDP 的 TLR 抑制的化学计算。用 CpG (I y M、2 y M、4 y M、8 y M)(图 5A)或 poly I:C(10ii g/ml 或 25ii g/ml)(图 5B)培养 Raw264. 7 细胞 18 小时。同时给 TLR 配体补充不同浓度 UfCpG*0、4、8、12、16、20、24、36、48iig/ml ;对 polyl: C 为 O、10、20、30、40,80,160 u g/ml)的 CDP。通过 ELISA 测定 TNF a 的量。通过([CpG 或 poly I: C]-[CpG或 poly I:C+Q)P])/[CpG 或 poly I :C]xl00 来计算 ％抑制。
图6.阳离子分子的细胞毒性。用不同浓度(10、20、40、80、160、280、400和600ii g/ml)的CDP(黑)、HDMBr (红)、PAMAM(蓝)、PPA-DPA(绿)、鱼精蛋白(灰)或聚L-赖氨酸(紫)培养IxlO6个Raw264. 7细胞。以台盼蓝(Sigma，St. Louis, MO)染色后用血细胞计分析细胞的存活力。
图7A 图7D.细胞的CDP增强的CpG摄取。在8_孔腔式载玻片(Nalge NuncInternational Corp, Naperville, IL)中过夜培养 Raw264. 7 细胞(IxlO5 细胞 / 孔)。用冷完全培养基洗涤三次后，给细胞补充包含I U M在5’末端与6-FAM共轭的CpG的新完全培养基并补充或不补充IOy g/ml的⑶P。在4°C或37°C下培养细胞I小时(图7A和图7C)或 2 小时(图 7B 和图 7D)。用 Olympus 1X71 倒置显微镜(Olympus, Center Valley, PA)观察突光信号。用Olympus DP Controller Ver. I. 2. I. 108分析图像。数据表示两个独立的实验，放大率为40X。

5 200、5 100、5 50、50 100、50 200、50 300、50 350、100 200、100 300、100 350,200 350,200 300或250 350)并且可具有例如2，000 50，000 (例如，10，000 50，000 或 20，000 40，000)的分子量。表I


本发明总体而言涉及模式识别受体(PRR)，包括Toll样受体(TLR)，并且具体而言涉及使用与核酸结合的试剂(“核酸结合剂”)优选以与能诱导TLR活化的核酸的核苷酸序列、化学物质(例如有或没有碱基或糖修饰的DNA或RNA)和/或结构(例如双链或单链的，与例如蛋白质复合或未复合的)无关的方式来抑制例如内体TLR的核酸诱导活化的方法。本发明还涉及鉴别适合用于该方法的核酸结合剂的方法。