iPS细胞及其制造方法[0002]iPS细胞也被称为人工多功能性干细胞或诱导多功能性干细胞，是能够获得与ES细胞同等分化多功能性的细胞。[0003]ES细胞、iPS细胞等具有分化多功能性的细胞，由于保持向构成机体的全部脏器和组织分化的能力，在再生因任何疾病而受损的脏器、血液、骨髓、组织等上作为极其有效的手段备受期待。[0004]但是，从ES细胞得到的血液、骨髓、组织、脏器等机体材料，在移植阶段有引起排斥反应的担心，必须克服这样的免疫性问题，还在伦理上的问题受到指责。另一方面，由于iPS细胞能够使用本人的体细胞来制作，没有免疫排斥的问题，也没有伦理上的问题。[0005]山中伸弥教授等的团队在小鼠的成纤维细胞中导入了作为Yamanaka factors的4种重编程因子(reprogramming factor),制作了 iPS细胞(非专利文献1、2),但在应用于医疗时有以下的问题。[0006]1.有细菌DNA等外源基因整合到宿主细胞基因组的担心。[0007]2.由常规方法得到的iPS细胞以一定的概率癌化，在安全性方面存在问题。[0008]3.对外来基因过量表达 得到的iPS细胞，不能预计多功能性以外的影响。
[0009]现有技术文献
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Takahashi 等，Cell2006,126:663-676
[0012]非专利文献2:0kita 等，Nature2007，448:313-317


[0013]发明所要解决的课题
[0014]本发明的目的在于提供无癌化担心、安全的iPS细胞。
[0015]用于解决课题的方法
[0016]本发明人等鉴于上述课题进行了研究，惊人地发现，使连接蛋白(connexin)抑制因子和TGFii信号转导抑制因子作用于细胞，能够不进行基因导入地建立iPS细胞。
[0017]本发明是提供以下的iPS细胞及其制造方法、iPS细胞诱导剂、iPS细胞诱导用培养基、iPS细胞诱导用试剂盒的发明。
[0018]项1.一种制作iPS细胞的方法，其特征在于:使至少I种连接蛋白抑制因子和至少I种TGFP信号转导抑制因子作用于细胞。
[0019]项2.如项I所述的方法，其中，连接蛋白抑制因子为连接蛋白43抑制因子。[0020]项3.如项I或2所述的方法，其中，上述连接蛋白抑制因子是对连接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体。
[0021]项4.如项I?3中任一项所述的方法，其中，上述TGFP信号转导抑制因子为TGF-β受体I抑制剂。
[0022]项5.如项I?4中任一项所述的方法，其中，上述TGF-β受体抑制剂为SB-431542、A-83-01 或 ALK5 抑制剂。
[0023]项6.含有至少I种连接蛋白抑制因子的iPS细胞。
[0024]项7.如项6所述的iPS细胞，其中，连接蛋白抑制因子为连接蛋白43抑制因子。
[0025]项8.如项6或7所述的iPS细胞，其中，上述连接蛋白抑制因子是对连接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体。
[0026]项9.一种含有选自连接蛋白抑制因子和TGF0信号转导抑制因子中的至少I种抑制因子的iPS细胞诱导剂。
[0027]项10.—种含有选自连接蛋白抑制因子和TGF β信号转导抑制因子中的至少I种抑制因子的iPS细胞诱导用培养基。
[0028]项11.一种含有选自`连接蛋白抑制因子和TGF β信号转导抑制因子中的至少I种抑制因子的iPS细胞诱导用试剂盒。
[0029]发明的效果
[0030]根据本发明的方法，不必导入外源基因(特别是原癌基因)，不使用病毒，因此，不改变iPS细胞以外的形质，癌化和感染的担心极低、是安全的，能够制作对人的实用化具有非常大的优点的iPS细胞。
[0031]由本发明得到的iPS细胞，确认以下4点。
[0032]1.多功能性细胞标记因子的表达以基因水平、蛋白质水平保持。
[0033]2.通过向小鼠皮下移植，形成畸胎瘤，能够分化诱导为腺管、软骨、神经等三胚层的全部细胞。
[0034]3.形成类胚体，根据分化诱导条件，能够分别分化为内皮细胞、神经细胞、心肌细胞，分化诱导得到的心肌细胞能够发挥生理功能。
[0035]4.能够制作嵌合小鼠。
[0036]另外,本发明的iPS细胞能够制作生殖系(Germ line)。
[0037]因此，由本发明提供的iPS细胞用于制作在再生医疗等中使用的生物材料是非常优异的细胞。



[0038]图1表示本发明的实施例中得到的细胞的结果。a.siPSCs的形态类似于小鼠ES。b.siPSCs的ALP活性得到了认可。c.通过各种抗多功能性标记抗体(Nanog、0ct4、Sox2、SSEA1)的免疫染色，能够在蛋白质水平确认了表达。d.通过RT-PCR，各种抗多功能性标记基因的表达在基因水平得到了确认。e.通过在SCID小鼠的皮下进行移植，形成畸胎瘤，确认了腺体、软骨.肌肉、神经.上皮。[0039]图2表示来自EGFP小鼠心肌的siPSCs的形态。
[0040]图3表示siPSCs细胞的嵌合小鼠制作。a.表示从siPSCs_#l得到的嵌合小鼠。b.表示从siPSCs-#2得到的嵌合小鼠。
[0041]图4是表示TGF信号转导的概略图。

[0042]在本说明书中，“iPS细胞”是指也称为人工多功能性干细胞或诱导多功能性干细胞的获得了分化多功能性的细胞。本发明中得到的iPS细胞，能够分化为内胚层、外胚层、中胚层全部(参照图1)，能够制作嵌合小鼠(图3)和生殖系。
[0043]“连接蛋白(Cx)”是参与间隙连接的蛋白质的总称，根据分子量，命名为Cx43(43kDa)等。作为连接蛋白的具体例子,可以列举Cx26、Cx30、Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx50等。现在已知超过20种的连接蛋白，今后所发现的连接蛋白类也包括在本发明中抑制对象的连接蛋白中。关于连接蛋白的种类和表达，在总说(Oyamada等，BBA, 2005,1719:6-23)中有详细叙述，该记载在本说明书中作为参考援引。在以下的表中总结连接蛋白的种类和表达部位。
[0044][表I ]