一种含虫草多糖生物制剂的制备方法[0002]糖尿病是一种常见的内分泌代谢综合疾病，以糖代谢紊乱为主要特征，表现为高血糖，糖尿及多种并发症，典型的临床表现为“三多一少”，即多饮、多食、多尿，体重减轻[I]。据WHO报告，糖尿病发病率逐年升高，已成为继恶性肿瘤、心脑血管病后第3位严重威胁人类健康的慢性疾病[2]。[0003]目前西医对糖尿病的治疗主要以消炎止痛或激素类药物为主，存在费用高、毒副作用大、疗效单一、治疗效果不理想等缺点。随着人类对健康愈加重视，糖尿病药物已从西药转向兼具食药两用的天然降血糖食品，其来源广泛，无毒副作用，用法简单，价格低廉，易被人们接受，逐渐成为了糖尿病患者日常保健与辅助治疗的最佳手段。近年来，国内外对冬虫夏草的研究取得了长足进展。[0004]目前用于治疗糖尿病的天然生物制剂主要是冬虫夏草胶囊、粉剂，是由冬虫夏草子实体粉碎成粉 制成的生物制剂，作用机理是缓解胰岛素抵抗，减轻β细胞的负荷，对糖尿病患者有显著疗效，但是存在以下不足:1、人工培育冬虫夏草子实体一般工厂在技术很难达到。2、大规模生产价格昂贵，经济效益低。3、原料单一，功效单一，只针对单因素引起的高血糖症，不能全面降糖。[0005]作为天然保健药物，虫草多糖具有极高的应用价值。我国现报道有关虫草多糖的开发利用多集中于其活性物质的提取及有效成分的获得，对虫草多糖的产品开发和功效研究较少，利用虫草多糖与食药两用的天然食品配伍降血糖更鲜为人知，如何高效利用这一极具保健功能和医疗价值的资源已成为目前亟待解决的问题。[0006]冬虫夏草{Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)属麦角菌科虫草属，寄生于蝙fe紙iHepialus armoricanus)幼虫上的子座和虫体复合体,主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、云南等地，是我国特产的名贵药材。冬虫夏草中含有丰富的虫草多糖(Polysaccharidesfrom cultured mycelium of Cordyceps sinensis , PCS )，对防治糖尿病功效尤为突出。胰岛素抵抗是糖尿病发病的前奏，虫草多糖能缓解胰岛素抵抗，降低胰岛素抵抗指数，不仅可以降低血糖，而且可以减轻β细胞的负荷，阻止病情的恶化，具有潜在的胰岛素增敏作RR [3-4]
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[0007]一些果蔬具有明显的降血糖功效。苦瓜(Jfomordi ca charantia L.)含多种降血糖活性成分，主要有三萜类、植物甾醇、苷类、甾体类和肽类等[5_61。苦荞(Fagopyrumtataricum (L.) Gaertn.)具有多种生物类黄酮，能清除体内自由基、修复受损的胰岛B细胞，对糖尿病实行双向调节m。药理学实验表明，给糖尿病患者服用麦冬japonicus (Thunb.) Ker-Gawl.)胶囊降糖效率为91.49%,且能稳定血糖,改善胰岛素敏感性M。青钱柳paliurus.)提取物具有降血糖、降血脂等生理活性,在防治糖尿病方面功效尤为突出[941]。酸楽L.var.franchetii (Mst.)Makino)又名锦灯笼，其果实、带果实的宿萼水提醇沉液均具有明显的抑制血糖升高作用[i2-H]。马齿觅ohracea)水煎浓缩剂能减轻2型糖尿病大鼠体重,改善糖耐量和脂代谢紊乱，降低血清游离脂肪酸，减轻高胰岛素血症，提高胰岛素敏感性[15_16]。


[0008]本发明的目的在于提供一种含虫草多糖生物制剂的制备方法，本发明采用人工培养中国被毛孢菌丝体提取虫草多糖为主要原料，与酸浆，青钱柳，苦荞，苦瓜，麦冬，马齿苋多种原料配伍降糖比单一虫草多糖降糖效果好，全面降糖、无毒副作用、价格低廉，适合规模生产。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种含虫草多糖生物制剂的制备方法，所述方法包括以下制备过程:
(1)虫草菌培养基制备:虫草需要在培养基上培养，需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基；
(2)虫草菌培养:首先从经活化的斜面菌种取菌苔块接入种子培养基，培养种子液；其次将种子液接入发酵培养基，在相同的条件下发酵得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液；
(3)虫草多糖粗提:将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，烘干；准确称取待测冬虫夏草样品放人具塞三角瓶，按料液比加人蒸馏水并混匀；置水浴浸提，趁热离心取上清液，减压浓缩加人乙醇溶液静置，然后离心收集沉淀，依次加人无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀， 冷冻干燥解析至恒质量，即得冬虫夏草粗多糖；
(4)虫草多糖纯化:取冬虫夏草粗多糖配制成溶液备用，将胰蛋白酶配制成溶液，将粗多糖与胰蛋白酶混合，对虫草多糖提取液酶解，将多糖提取液酶解后放入水浴锅中灭酶，冷却至室温，离心弃去沉淀，取上层清液，将TCA溶液加入到上清液中，充分反应，离心后取上清液，浓缩后加入乙醇静置，离心得沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，抽滤，干燥后得冬虫夏草多糖；
(5)成型:将苦瓜，苦荞，麦冬，青钱柳，酸浆，马齿苋切成小块，在60°C下烘干，粉碎；以虫草多糖30%，酸浆25%，青钱柳15%，苦荞10%，苦瓜10%，麦冬5%，马齿苋5%的比例将原料充分混合，再结合药用辅料制成制剂即可。
[0010]所述的一种含虫草多糖生物制剂的制备方法，所述斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基的配方及份数为:斜面培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏IOg,蚕蛹粉 10g，蛋白胨 10g，KH2PO4 3g, MgSO4.7H20L 5g，维生素 B1 IOmg,琼脂 2.0,水1000ml，pH7-8 ;种子培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g, MgS04*7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000ml，pH7_8 ;发酵培养基马铃薯200 g，蔗糖 10 g，蛋白胨 10g，大豆粉 lOg，KH2PO4 3g, MgSO4.7Η20 1.5g,维生素B1 IOmg,水 1000 ml O
[0011]本发明的优点与效果是:
1、本发明采用人工培养中国被毛孢菌丝体提取虫草多糖为主要原料，与酸浆，青钱柳，苦荞，苦瓜，麦冬，马齿苋多种原料配伍降糖比单一虫草多糖降糖效果好，是目前独一无二的配方。[0012]2、本发明研制的虫草多糖降血糖生物制剂根据各种高血糖病因全面降糖，安全性闻。
[0013]3、本发明研制的虫草多糖降血糖生物制剂不是活菌制剂，因此具有有效期长、与其它药物相容性好等优点。
[0014]4、本发明研制的虫草多糖降血糖生物制剂价格低廉，适合大规模生产。

[0015]下面结合实施例，对本发明作进一步详述。
[0016]实验例I
(I)虫草菌培养基 制备
虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下:
斜面培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蚕蛹粉10g，蛋白胨10g，KH2PO43g, MgSO4.7Η201.5g，维生素 B1 IOmg,琼脂 2.0,水 1000ml，pH7_8。
[0017]种子培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g,MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000ml，pH7_8。
[0018]发酵培养基马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g，KH2PO4 3g,MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000 ml。
[0019](2)虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢sinensis)，购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
[0020]首先从经活化的斜面菌种取5mm2大小的菌苔4块接入种子培养基(装液量为100mL三角瓶)内，于24°C旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为200ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
[0021](3)虫草多糖粗提
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60°C条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:30加人蒸馏水并混匀。置于85°C水浴浸提3h，趁热离心(2500rpmX 20min)取上清液，50°C减压浓缩至200ml，加人4倍体积95%乙醇溶液，4°C静置12h，3000 r/min离心15min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于_25°C冷冻干燥在35°C解析至恒质量，即得冬虫夏草粗多糖。
[0022](4)虫草多糖纯化
取冬虫夏草粗多糖配制成浓度为10mg/ml的溶液备用。将胰蛋白酶配制成浓度为10mg/ml的溶液，保持酶解温度为37°C，pH为7.5，将粗多糖与胰蛋白酶按12:1混合，对虫草多糖提取液酶解45 min，将多糖提取液酶解后放入100°C水浴锅中灭酶5min，冷却至室温。3500 r/min离心5min弃去沉淀，取上层清液。将浓度为20%的TCA溶液加入到上清液中，使TCA溶液终浓度为6%。静置12h充分反应，3500 r/min离心5 min,取上清液，浓缩至相对密度为1.05 (20 V )，加入乙醇至体积分数达80%，静置12h，离心得沉淀物，依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，抽滤，干燥后得冬虫夏草多糖。[0023](5)成型
将苦瓜，苦荞，麦冬，青钱柳，酸浆，马齿苋切成小块，在60°C下烘干，粉碎。以虫草多糖30%，酸浆25%，青钱柳15%，苦荞10%，苦瓜10%，麦冬5%，马齿苋5%的比例将7种原料充分混合，再结合药用辅料制成不同的制剂，如胶囊剂、片剂、口服液等。
[0024]实验例2、
(I)虫草菌培养基制备
虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下:
斜面培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蚕蛹粉10g，蛋白胨10g，KH2PO43g, MgSO4.7Η201.5g，维生素 B1 IOmg,琼脂 2.0,水 1000ml，pH7_8。
[0025]种子培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g,MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000ml，pH7_8。
[0026]发酵培养基马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g，KH2PO4 3g,MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000 ml。
[0027](2)虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢sinensis)，购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
[0028]首先从经活化的斜面菌种取IOmm2大小的菌苔6块接入种子培养基(装液量为250ml三角瓶)内，于24°C旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为500ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
[0029](3)虫草多糖粗提
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60°C条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:30加人蒸馏水并混匀。置于85°C水浴浸提3h，趁热离心(2500rpmX 20min)取上清液，50°C减压浓缩至200ml，加人4倍体积95%乙醇溶液，4°C静置12h，3000 r/min离心15min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于_25°C冷冻干燥在35°C解析至恒质量，即得冬虫夏草粗多糖。
[0030](4)虫草多糖纯化
取冬虫夏草粗多糖配制成浓度为10mg/ml的溶液备用。将胰蛋白酶配制成浓度为10mg/ml的溶液，保持酶解温度为37°C，pH为7.5，将粗多糖与胰蛋白酶按12:1混合，对虫草多糖提取液酶解45 min，将多糖提取液酶解后放入100°C水浴锅中灭酶5min，冷却至室温。3500 r/min离心5min弃去沉淀，取上层清液。将浓度为20%的TCA溶液加入到上清液中，使TCA溶液终浓度为6%。静置12h充分反应，3500 r/min离心5 min，取上清液，浓缩至相对密度为1.05 (250C )，加入乙醇至体积分数达80%，静置12h，离心得沉淀物，依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，抽滤，干燥后得冬虫夏草多糖。
[0031](5)成型
将苦瓜，苦荞，麦冬，青钱柳，酸浆，马齿苋切成小块，在60°C下烘干，粉碎。以虫草多糖30%，酸浆25%，青钱柳15%，苦荞10%，苦瓜10%，麦冬5%，马齿苋5%的比例将7种原料充分混合，再结合药用辅料制成不同的制剂，如胶囊剂、片剂、口服液等。[0032]实例3
(I)虫草菌培养基制备
虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下:
斜面培 养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蚕蛹粉10g，蛋白胨10g，KH2PO43g, MgSO4.7Η201.5g，维生素 B1 IOmg,琼脂 2.0,水 1000ml，pH7_8。
[0033]种子培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000ml，pH7_8。
[0034]发酵培养基马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g，KH2PO4 3g,MgSO4.7H20 1.5g,维生素 B1 IOmg,水 1000 ml。
[0035](2)虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢sinensis)，购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
[0036]首先从经活化的斜面菌种取6mm2大小的菌苔5块接入种子培养基(装液量为250ml三角瓶)内，于24°C旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为500ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
[0037](3)虫草多糖粗提
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60°C条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:30加人蒸馏水并混匀。置于85°C水浴浸提3h，趁热离心(2500rpmX 20min)取上清液，50°C减压浓缩至200ml，加人4倍体积95%乙醇溶液，4°C静置12h，3000 r/min离心15min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于_25°C冷冻干燥在35°C解析至恒质量，即得冬虫夏草粗多糖。
[0038](4)虫草多糖纯化
取冬虫夏草粗多糖配制成浓度为10mg/ml的溶液备用。将胰蛋白酶配制成浓度为10mg/ml的溶液，保持酶解温度为37°C，pH为7.5，将粗多糖与胰蛋白酶按12:1混合，对虫草多糖提取液酶解45 min，将多糖提取液酶解后放入100°C水浴锅中灭酶5min，冷却至室温。3500 r/min离心5min弃去沉淀，取上层清液。将浓度为20%的TCA溶液加入到上清液中，使TCA溶液终浓度为6%。静置12h充分反应，3500 r/min离心5 min，取上清液，浓缩至相对密度为1.05 (200C )，加入乙醇至体积分数达80%，静置12h，离心得沉淀物，依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，抽滤，干燥后得冬虫夏草多糖。
[0039](5)成型
将苦瓜，苦荞，麦冬，青钱柳，酸浆，马齿苋切成小块，在60°C下烘干，粉碎。以虫草多糖30%，酸浆25%，青钱柳15%，苦荞10%，苦瓜10%，麦冬5%，马齿苋5%的比例将7种原料充分混合，再结合药用辅料制成不同的制剂，如胶囊剂、片剂、口服液等。
[0040]下面通过一个典型实验来说明含虫草多糖的降血糖药物在降血糖方面有益。
[0041](I)实验方法:
2014年1-4月期间选用40只体重均在25g的雄性昆明小鼠，注射链脲佐菌素，造糖尿病小鼠模型。之后将40只小鼠平均分为A、B、C、D、E、F、G、H组，以下述重量(干物料)配比的原料制成的制剂灌胃小鼠:虫草多糖30%，酸浆25%，青钱柳15%，苦荞10%，苦瓜10%，麦冬5%,马齿苋5%。
[0042] (2)实验结果
有8组小鼠原平均血糖值为13.6mmol/L,服用该配方一个月之后，平均血糖降至6.5mmol/L ;有4组小鼠的平均血糖值由原13.2mmol/L降至5.3mmol/L;有I组的效果不是特别明显，但也有所下降，即平均血糖值由原12.7mmol/L降至8.6mmol/L。
[0043]通过实验显示，小白鼠服用30天后其血糖有明显下降，效率为100%。并且这种配方服用后不会伤及肠胃，具有一定的保健功效。