专利名称：一种牛、羊用冷冻精液稀释液配方及制作方法稀释液是牛、羊等精液冷冻时必不可少的组成成分，在冷冻过程中对精子起到稀释、缓冲、营养和保护的作用，有效降低低温对精子的影响。尽管国内的冷冻精液制作及人工授精技术已应用多年，但冷冻精液解冻后精子活力(359^40%)仍低于国外水平(50%飞0%)。精液在经过超低温冷冻解冻后，精子的活力降低、死亡数量与畸形率增加，其原因是精子受冷打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活力及受精能力
本发明的目的在于提供一种能有效提高冷冻精液解冻后精子活力，顶体完整率，降低精子畸形率的牛羊用冷冻精液稀释液配方以及制备方法。本发明通过在精液中加入一定量的稳定剂及活性物质，可以有效地起到保护精子的作用。本发明采用添加一定浓度的BSA (牛血清蛋白)及Vb12注射液可以对精子起到一定的保护作用，有效地提高精子活力及顶体完整率，降低精子畸形率。本发明采用如下技术方案 一种牛羊用冷冻精液稀释液配方，每IOOmL稀释液的配方为朽1檬酸I. 35^1. 55g,三羟甲基氨基甲烷(tris)2. 4 2. 6g，葡萄糖I. (Tl. 2g，甘油4. 5 6. 8ml，卵黄18. 0 21ml，牛血清白蛋白(BSA)4. 5 7. 5ml，维生素B12 0. 45 0. 75ml，青霉素钾5 10万IU,硫酸链霉素5 10万IU,余量为蒸懼水。一种牛羊用冷冻精液稀释液配方的制作方法，包括如下步骤 (1)基础液的配制取柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷(tris)、葡萄糖、加入蒸馏水中，配制成基础液A ； (2)卵黄液的制备选取新鲜鸡蛋，将蛋壳消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄； (3)将基础液A过滤后，在65°C下进行巴氏消毒灭菌30分钟，温度低于30°C后分别加入经过灭菌的甘油、卵黄，加入牛血清白蛋白(BSA)和维生素B12，搅拌均匀，将PH值调整为6. 5 7. 5之间，即配制成B液； (4)使用前,在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素，即可使用。使用本发明配方时，可以 I、根据原精精液量、活力及密度换算后确定所需的稀释液添加量。本发明配方可直接加入牛的原精液中，以达到稀释的目地。2、对于稀释液添加量低于IOOml时，可直接将本品分多次加入牛精液中进行稀释；若稀释液添加量超过IOOml时，可分两次加入，初次加入原精液体积的3 5倍，后将剩余稀释液与初步稀释后的精液一同放入平衡柜中平衡，分装前30分钟，将剩余稀释液加入精液中，再放入平衡柜中直至分装。本发明具有如下优点及效果
I、与国标稀释液配方相比，成本低，配制以及使用操作步骤较为简便。2、能够有效提高精子的活力(459^55%)、顶体完整率(> 68%)，质膜完成率(彡50%)，降低精子畸形率(彡15%，其中绵羊彡18%)。3、体外授精试验显示精子穿卵能力增加145%。4、本发明配方使用范围较广，在肉牛、奶牛、山羊及绵羊精液的制作中均取得良好效果，其精子活力彡45%，顶体完整率彡68%，质膜完整率(彡50%)，精子畸形率彡15% (绵羊 精子畸形率< 18%)。
具体实施例实施例I :
(I)基础液的配制取柠檬酸I. 353g，三羟甲基氨基甲烷(tris) 2. 422g，葡萄糖I. Ig,加入68. 5ml蒸懼水中，配制成基础液A。(2)卵黄液的制备选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。(3)将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌(65°C 30分钟)，温度低于30°C后分别加入经过灭菌的甘油5. 0ml，卵黄20ml，加入6ml牛血清蛋白(BSA)和0. 5ml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6. 5^7. 5之间，即配制成B液。(4)使用前,在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各5万IU，即可使用。(5)本配方使用效果最好。实施例2:
(I)基础液的配制取柠檬酸I. 45g，三羟甲基氨基甲烷(tris) 2. 56g，葡萄糖I. 0g，力口A 68. 4mI蒸懼水中，配制成基础液A。(2)卵黄液的制备选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。(3)将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌(65°C 30分钟)，温度低于30°C后分别加入经过灭菌的甘油6. 5ml，卵黄18ml，加入6. 5ml牛血清蛋白(BSA)和0. 6ml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6. 5^7. 5之间，即配制成B液。(4)使用前,在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各7. 5万IU，即可使用。实施例3
(I)基础液的配制取柠檬酸I. 55g，三羟甲基氨基甲烷(tris) 2. 48g，葡萄糖I. 2g，力口A 64. 8ml蒸懼水中，配制成基础液A。(2)卵黄液的制备选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。(3)将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌(65°C 30分钟)，温度低于30°C后分别加入经过灭菌的甘油6. 0ml，卵黄21ml，加入7. 5ml牛血清蛋白(BSA)和0. Iml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6. 5^7. 5之间，即配制成B液。(4)使用前,在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各10万IU，即可使用。需要注意的是，本发明中
I、所用的化学药品一般为化学纯或为分析纯，使用前均进行溶解过滤。2、使用的鸡蛋应选取当日产鲜鸡蛋，并经酒精进行表面消毒，取卵黄时一定不要混入蛋白与卵黄膜。3、甘油使用前须经高压灭菌，灭菌压力0. 1-0. 15MPa, 20分钟。
4、青霉素与链霉素以人用药品最优。5、配制后的稀释液应保存至4 6°C环境中，应注意密封保鲜不受污染。


本发明提供一种牛羊用冷冻精液稀释液配方，每100mL稀释液的配方为柠檬酸1.35~1.55g，三羟甲基氨基甲烷(tris)2.4~2.6g，葡萄糖1.0~1.2g，甘油4.5~6.8ml，卵黄18.0~21ml，牛血清白蛋白(BSA)4.5~7.5ml，维生素B120.45~0.75ml，青霉素钾5~10万IU，硫酸链霉素5~10万IU，余量为蒸馏水。本发明配方成本低，配制以及使用操作步骤较为简便，能够有效提高精子的活力、顶体完整率，质膜完整率，降低精子畸形率。