专利名称：一株高效转化去氢表雄酮的菌株及其应用的制作方法一株高效转化去氢表雄酮的菌株及其应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一株赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1 及其高效转化去氢表雄酮为7 α -羟基-去氢表雄酮的方法。去氢表雄酮(DHEA)和7 α -轻基-去氢表雄酮(7 α -0H-DHEA)是自然界生物体内重要的活性物质，对代谢具有重要的调节作用，而后者是前者在生物体内的氧化代谢产物， 和DHEA有共同的免疫调节作用。目前，有研究发现7 α -OH-DHEA在阻止体外神经元的缺氧细胞死亡方面比DHEA活性更强；其抗氧化活性也超过DHEA ；另外，7 α -OH-DHEA的抗肿瘤作用明显，对肿瘤的增生有极强的抑制作用。由于7 α-OH-DHEA较强的免疫调节功能和抗肿瘤作用，将其作为一种具有重要药理作用和药用价值的羟基留体化合物，应用前景十分看好，成为当前药物研究领域中的热点之一。合成7 α -OH-DHEA的传统方法是采用相同或相近的结构母核类似物进行化学合成，但是7 α -OH-DHEA对立体选择性要求高，通常会造成产物得率低，副产物多，产品后续分离纯化过程复杂等问题。近年来，国内外研究者开始考虑生物转化法将DHEA特异性转化为7 α -0H-DHEA,该反应具有条件温利，安全低耗、易操作、转化率高且环境友好等特点。据相关文献报道，目前已有总状毛霉(Mucor racemosus)等菌株具备转化DHEA为 7 α -OH-DHEA的能力。但由于DHEA是脂溶性化合物，在水相中溶解度极低，造成转化过程中底物投料浓度和转化效率都非常低，这些问题直接成为7 α-OH-DHEA工业生产中的瓶颈。因此，筛选一株高效转化DHEA的微生物具有非常重要的意义，而目前关于赤霉菌 (Gibberella intermedia) CA3-1用于转化DHEA的研究未见报道，其高底物投料浓度更是工业生产的一大优势。发明内容本发明的目的在于提供一株高效转化DHEA的赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1，以及利用该菌株转化DHEA为7 α -OH-DHEA的方法，可达到高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。本发明的发明人从国内合成甾体化合物的化工厂厂房周围的士壤样品中分离筛选获得一株赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1，该菌于2011年5月M日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4903。应用上述微生物转化DHEA生产7 α -OH-DHEA的方法，其步骤如下(1)采用保藏号为 CGMCC No. 4903 的赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1 为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到PDA培养基上；(2)制备CA3-1菌株的细胞液体培养物挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的 CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-60mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为 25-40°C，置摇床上以120-220r/min的转速培养12-1 至对数生长中期，即得到CA3-1菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养将步骤( 中制备好的细胞液体培养物以4-8% (w/w)的接种量接入发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装20-60mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在 120-220r/min的转速下培养20_24h，得发酵液。
(4)生物转化精确称取适量DHEA，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为 5_8g/L，在转化温度^°C，200-220r/min的转速下转化36_48h，即得转化液。
(5)产物检测将步骤的转化液在8000-12000r/min下离心5-lOmin，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，沉淀用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0. 22 μ m的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析DHEA和7 α -OH-DHEA的含量。
其中步骤(1)中所述的PDA培养基的成分及配比为土豆200-500g/L;葡萄糖 20-50g/L ；酵母粉2-10g/L ；琼脂粉10_20g/L ；pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ；步骤( 所述种子培养基的成分及配比为花生饼粉5-15g/L，葡萄糖20-50g/L ；KCl l_5g/ L ；酵母粉 10-30g/L ；K2HPO4 0. 1-5. Og/L ；MgSO4 · 7H20 0. l_5g/L ；FeSO4 · 7H20 g/L ；灭菌前调培养基的PH至6. 5-7. 5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ；步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为葡萄糖20-50g/L ；酵母粉10-30g/L ；蛋白胨5_20g/L ；玉米浆3-lOg/L ；NaCl 0. 2-2g/L ；K2HPO4 0. 1-1. Og/L ；MgSO4 0. Ι—lg/L ；FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 10g/L ；pH 6. 5-7. 5， 121°C高压蒸汽下灭菌20min。
本发明所述的赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1菌株首次发现可转化DHEA 生成7 α -0H-DHEA,并且能达到高底物投料量、高底物转化率、高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。


图1为本发明的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1在发酵培养基中转化 DHEA的过程研究。

实施例1赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1的分离鉴定以及菌株的保存
(1)赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1 的分离、筛选
本发明从国内合成留体化合物的化工厂厂房周围取得土样，称取1.0-2. Og 土样于250mL三角瓶中，用10-50mL生理盐水悬浮，然后置于水浴锅中，60°C处理lOmin，冷却后进行梯度稀释，取0. 2mL稀释液涂布于DHEA为唯一碳源的固体平板上进行初筛。30°C条件下培养4 后，选取长势较好的单菌落进行发酵验证。挑取单菌落接种到新鲜的液体种子培养基，30°C、120-220r/min培养Mh，再以8% (w/w)的接种量接入装液量为30mL/250mL 的发酵培养基，相同培养条件下培养20-24h至菌体进入对数中后期，然后投入适量的 DHEA, 280C、120-220r/min转速下转化36h，收集转化液，经乙酸乙酯抽提和0. 22 μ m的有机膜处理后，采用高效液相色谱检测底物DHEA的转化率和产物7 α -OH-DHEA的得率。
(2)赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1 的鉴定
生理生化鉴定参照伯杰真菌鉴定手册第8版。4
该菌株在查氏培养基上培养7d后，菌落圆形，边缘平整，白色不透明，菌苔湿润易挑取，菌落边缘和中心及正反面颜色均一致，气生菌丝发达，为白色疏松的棉絮状，气生菌丝分枝，透明，直径1. 8-3. 8 μ m,在气生菌丝中有以假头状着生的小型分生孢子，其大小为 12 μ mX 1. 8 μ m,近似卵形，无隔，光滑；大型分生孢子数量极多，椭圆形弯曲或呈镰刀形，大部分为假头状着生。
(3)菌株保存挑取一环赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1菌株接种于PDA 液体培养基中，30-40°C，200r/min振荡培养对-3他后，取0. 5mL的细胞培养液转入装有 0.5mL的60%甘油保藏管中，-20°C冷冻保藏。该菌2011年5月M日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo. 4903。
实施例2 利用赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1 转化 DHEA
(1)制备赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株的细胞液体培养物
挑取固体PDA培养基上的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株一环，接种在装有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200r/min的转速培养 20-24h至对数期，即制得赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株的细胞液体培养物。
(2)发酵培养基的成分及配比为葡萄糖20_50g/L ；酵母粉10_30g/L ；蛋白胨 5-20g/L ；玉米浆 3-10g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；K2HPO4 0.1-1. Og/L ；MgSO4 0.Ι-lg/L ； FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 10g/L ；pH 6. 5-7. 5，121 °C 高压蒸汽下灭菌 20min。
(3)摇瓶发酵将上述亦霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株的细胞液体培养物以4-8% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在 30-40°C条件下，置于摇床上以120-200r/min的转速培养，发酵20_24h，菌体进入对数中后期。
(4)生物转化精确称取适量DHEA，投入步骤( 中的菌体发酵液，使DHEA终浓度为5g/L，在转化温度^°C，200-220r/min的转速下转化36_48h。


本发明属生物技术领域，涉及一株高效转化去氢表雄酮的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1及其应用，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4903。赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1能转化去氢表雄酮为7α-OH-去氢表雄酮，在底物投料量为5.2g/L的条件下，底物转化率高达90％，产物得率80％。