魏氏家藏方续断散在制备治疗老年性脑痴呆药物中的应用的制作方法 [0002] 作为常用的中药方剂，续断散仅被用于逐痹痛，其医药用途并没有得到充分的发 掘和应用。 [0003] 本发明具体针对由续断和牛膝两味中药组成的《魏氏家藏方》续断散的新应用进 行进一步探索。
[0004] 本发明的目的在于公开续断散在制备治疗多种疾病的药物中的应用，以满足临床 应用的需要。 [0005] 以补充外源性雌激素为主的激素替代疗法（Hormone Replacement Treatment, HRT)是近50年来预防医学的重要进展，目前对长期使用HRT仍存在争议。HRT 的益处主要有：①缓解并根除更年期症状；②减少或防止骨质疏松症及其相关骨折的发生 率；③降低缺血性心血管疾病发生的危险度和致死率；④预防和降低老年性痴呆发生的危 险性和改善痴呆的严重程度；⑤减少大肠癌发病的危险性；⑥改善尿失禁。HRT的弊端主要 有：①增加子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌的发病风险；②提高深部静脉血栓和肺静脉 栓的危险性；③增加心肌梗死的危险冠心病和脑卒中的几率增加，2002年7月美国国立卫 生院（NIH)下属心肺血液研究所发布最新实验结果，与安慰剂组相比，HRT组的冠心病相对 风险竟增加29%，脑卒中的相对风险增加41% ;④增加胆囊炎的发病率；⑤增加体重及不规 律出血的风险。
[0006] 依据发明人的实验，本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007] 《魏氏家藏方》续断散在制备治疗老年性脑痴呆的药物中应用。
[0008] 《魏氏家藏方》续断散在制备增强学习和记忆能力的药物中应用。
[0009] 《魏氏家藏方》续断散在制备治疗骨质疏松药物中应用；所述的骨质疏松可为由性 激素水平下降导致的骨质疏松。
[0010]《魏氏家藏方》续断散在制备降血脂的药物中应用。
[0011]《魏氏家藏方》续断散在制备治疗妇女更年期综合症的药物中应用。
[0012] 所述的续断散由续断和牛膝两味中药制成。续断可为盐炙续断、酒炙续断或生品 续断；牛膝为盐炙牛膝、酒炙牛膝或生品牛膝。
[0013] 所述的续断散的原料为重量比为1:1的盐炙续断与盐炙牛膝，或者重量比为1:1 的生品续断与生品牛膝，或者重量比为1:1的酒炙续断与酒炙牛膝。
[0014] 本发明所述的续断散为盐炙续断和盐炙牛膝按照1 :1的重量比例关系混合提取 得到的醇提取物，或生品续断和生品牛膝按照1 :1的重量比例关系混合提取得到的醇提取 物，或者酒炙续断和酒炙牛膝按照1 :1的重量比例关系混合提取得到的醇提取物。
[0015] 上述续断散具体是通过以下方法制备得到的：将原料混合后加入乙醇加热回流提 取，过滤，得到的提取液浓缩至无醇味即得；所述的乙醇浓度为60%-70%，优选乙醇浓度为 60%。所述的乙醇用量为原料总重的8-12倍量，优选乙醇体积用量为原料总重的10倍量， 乙醇提取次数为2-3次。
[0016] 所述的续断散可包括治疗有效量的原料药和医药学上可接受的载体制成丸剂、散 齐?、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、复方制剂或其他口服剂型。
[0017] 生品续断和生品牛膝即市售续断和牛膝药材，酒炙牛膝、盐炙牛膝、盐炙续断、酒 炙续断均为市售可得，也可以将牛膝和续断药材按照常规酒炙和盐炙方法炮制得到。
[0018] 根据上述应用，所述的续断散服用剂量可根据服用方式、病人年龄、病情严重程度 等因素而改变，成人口服剂量为20-60g (生药）/日。
[0019] 与现有技术比较本发明的有益效果：药效试验证明，《魏氏家藏方》续断散能显著 抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量；可以显著提高 骨密度、骨重系数、骨钙和骨磷，具有显著性治疗骨质疏松的活性，尤其是由性激素水平下 降导致的骨质疏松，在制备治疗骨质疏松的药物中具有很好的应用前景。《魏氏家藏方》续 断散能使雌激素 E2水平得到提高、子宫和乳腺中雌激素受体ER量得到提高，显示续断散具 有植物激素样作用，可减轻妇女更年期阴虚的表现，可制备治疗妇女更年期综合症的药物。 而甘油三酯TG、胆固醇TC水平的下调，显示《魏氏家藏方》续断散具有降血脂作用。另外， 药效试验还说明了《魏氏家藏方》续断散可治疗老年性脑痴呆，同时具有增强学习和记忆能 力的作用。


[0020] 以下通过具体试验例对本发明进一步解释说明。
[0021] 主要药品：
[0022] 仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司，批号：111043);羧甲基纤维素钠 (CMC-Na，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20070429);水合氯醛（国药集团化学试 剂有限公司，分析纯，批号：30037517);注射用青霉素钠（80万单位/支，山东鲁抗医药股 份有限公司，批号：B111106);碘伏（武汉市联华卫生消毒用品厂）；续断、牛膝（购于南京 市先声药店）。ER(MC-20)抗体（美国antaCruz公司，）；血清碱性磷酸酶（ALP)试剂盒 (南京建成生物工程研究所，批号：20120521);血清磷（P)试剂盒（南京建成生物工程研 究所，批号：20120607);血清钙（Ca)试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20120607); 羟脯氨酸（HOP)试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20120427);钙（Ca)试剂盒（南 京建成生物工程研究所，批号：20120607);磷（P)试剂盒（南京建成生物工程研究所，批 号：20120607);大鼠血清雌二醇试剂盒（E2,美国R&D公司，批号：20120601A);血清总胆固 醇（TC)试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514);血清甘油三酯（TG) 试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514);血清低密度脂蛋白（LDL-C) 试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514);血清高密度脂蛋白（HDL-C) 试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514)，Αβ 1-42 (invitrogen，批 号：73450114A)，盐酸多奈哌齐片（安理申，规格10mg/片，卫材（中国）药业有限公司，批号 120814A)，银杏叶提取物(徐州恒凯银杏制品有限公司，批号：N0111210)，水合氯醛(分析 纯，国药集团)，大鼠脑立体定位仪(江湾I型C)，微量注射器(上海精密激光仪器厂)，牙科 钻及手术器械等，Morris水迷宫系统(包括大鼠迷宫自动程序记录仪，中国药科大学药学 院)，KD-160 型鼠称（TANITA 公司），MILLI-QBiocel 型超纯水装置（Millipore，USA)。
[0023] 实验动物：雌性，280±20g，清洁级SD大鼠（南通大学实验动物中心），实验动物 生产许可证号：SCXK (苏）2008-0010。
[0024] 试剂配制：0. 5%CMC-Na :称取15g CMC-Na，加入3000mL蒸馏水，混合均匀，使其充 分溶胀，放置过夜，搅拌均匀，即得。
[0025] 3%水合氯醛：精密称取水合氯醛15g，加入500mL蒸馏水，使其充分溶解，即得到 3%水合氯醛麻醉液，在使用前现用现配。
[0026] 75%乙醇溶液：移取95%乙醇789. 5mL，加入210. 5mL蒸馏水，混合均匀，即得到 1000mL的75%乙醇溶液。
[0027] 0. 9%生理盐水溶液：称取4. 5g NaCl，加入500mL蒸馏水，混合均匀，使其充分溶 解，即得。
[0028] 10%的中性甲醛溶液：移取37%?40%甲醛溶液100mL，加入900mL的PBS缓冲溶 液，混合均匀，即得到l〇〇〇mL的10%中性甲醛溶液。
[0029] 仙灵骨葆胶囊混悬液：取仙灵骨葆胶囊内容物，用研钵研碎，精密称取5. 0g，置于 100mL容量瓶中，加入0. 5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。仙灵骨葆大鼠给 药体积为10mL/kg · cf1 ;给药量为0· 50g/kg[1]。
[0030] 17β-雌二醇混悬液：精密称取17β-雌二醇1. 5mg，置于250mL容量瓶中，加入 0. 5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。17 β -雌二醇给药体积为10mL/kg ?(Γ1 大鼠，给药剂量为eOyg/kg?。
[0031] 续断散(盐炙品）的制备方法：精密称取盐炙续断及盐炙牛膝粗粉（粉碎，过2号 筛）各250g (共500g)，置5L圆底烧瓶中，加入5L浓度为60%的乙醇，浸泡lh，水浴回流提 取三次，提取时间分别为1. 5h、lh、0. 5h，三次提取使用的60%乙醇用量分别为5L、4L、4L， 合并三次滤液，减压回收乙醇部位，浓缩至无醇味，浓缩后的药液置于真空减压干燥箱中 (-0. 08MPa，60°C )，干燥，研细得续断散提取物，得率为39. 83%，备用。续断散(生品)的原料 为按照1 :1重量比例混配的生品续断和生品牛膝；续断散(酒炙品)的原料为按照1 :1重量 比例混配的酒炙续断和酒炙牛膝，制备方法同续断散(盐炙品）。
[0032] 续断散提取物高剂量组药液：续断散提取物适量，用0. 5%CMC_Na溶解制成0. 24g/ mL的混悬液。给药体积为0. 01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为2. 4g/kg (6g生药/kg)大 鼠。
[0033] 续断散提取物低剂量组药液：续断散提取物适量，用0. 5%CMC_Na溶解制成0. 08g/ mL的混悬液。给药体积为0. 01mL/g大鼠；低剂量组给药剂量为0. 8g/kg (2g生药/kg)大 鼠。
[0034] 试验一：
[0035] 1.实验目的
[0036] 通过采用大鼠去卵巢的骨质疏松模型，以大鼠血清中羟脯氨酸（HOP)、血清中碱性 磷酸酶含量；股骨骨密度；股骨骨灰重系数；骨钙和骨磷含量作为考察指标，证明续断散治 疗去卵巢大鼠骨质疏松的在体药理活性。
[0037] 2.实验方法
[0038] 2. 1动物模型的制备
[0039] 取体重280±20g的6月龄清洁级雌性SD大鼠80只。随机分组，禁食24小时（不 禁水）后，其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为正常对照组(假手术对照组)； 其余72只按文献法进行卵巢摘除术，大鼠用3%水合氯醛麻醉（3g水合氯醛/100mL，给药 剂量l〇〇g动物/mL，腹腔注射），背位固定，于距最末肋骨下约lcm和脊柱外测约2cm处，剪 毛，然后切开约1. 5-2cm皮肤和背肌，切口视野中可见一团白色发亮的脂肪，卵巢即包埋在 其中，用小镊子轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到粉红色菜花状的卵巢，将 其余子宫连接处用4号手术缝合线结扎后，再摘除卵巢，同法摘除另一侧卵巢，术后顺势将 子宫送回原位，皮肤切口处给予少许青霉素粉剂，缝合切口。
[0040] 各组大鼠术后分笼饲养，大鼠术后活动正常，可自行饮水摄食，术后大鼠伤口愈合 正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。各组大鼠再分笼饲养，术后每日腹腔注射青霉素注射液 (生理盐水配制，10万单位/mL，给药体积0. 01mL/lg，80万单位/瓶），连续3天。手术2 周后开始给药，连续给药12周。
[0041] 2. 2动物分组及给药
[0042] 将去卵巢大鼠分别按体重随机分为6组：假手术组、模型对照组（0VX)、两组阳性 对照组、续断散的高剂量组和低剂量组。假手术对照组（SHAM)和模型对照组（0VX)，给予 蒸馏水；两组阳性对照组，分别给予仙灵骨葆胶囊0. 5g/kg (中阳）和17 β -雌二醇60 μ g/ kg (西阳）；续断散的高、低剂量组分别为2. 4g/kg(6g生药/kg)、和0. 08g/kg(2g生药/kg)。
[0043] 灌胃给药，给药体积为0. 01mL/g大鼠，每周给药6次（周日休息一天），均于每天 晚上18:00-20:00左右给药，连续给药12周，于给药过程中，每周称一次体重，根据体重调 整给药量。
[0044] 2. 3样品采集
[0045] 末次给药后禁食24小时（不禁水）后，先对大鼠进行称重，然后3%水合氯醛麻醉 (3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射），大鼠颈总动脉插管取血，至10mL 的离心管中并处死大鼠。
[0046] 血液室温静置15min，3500rpm离心10min后，分离血清及血浆，血清标号后，-20°C 保存，用于各指标含量测定。
[0047] 总动脉插管取血后处死大鼠，分离双侧股骨，取右侧股骨测定以下指标：①将标本 用10%的中性甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨骨密度；②再将测完骨密 度之后的右侧股骨干燥并碳化后置于800°C马福炉中灰化制成骨灰，测定骨灰重系数（mg/ g体重）；⑦称取一定量骨灰，用血清磷测定试剂盒测定骨磷；另取一定量的骨灰用钙试剂 盒测定骨钙含量，将所测结果折算成每克骨重所含骨钙或骨磷的量。
[0048] 2. 4实验各项指标测定及实验结果
[0049] 2. 4. 1羟脯氨酸（HOP)的含量测定
[0050] (1).基本原理：羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲 醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。
[0051] (2).测定方法：按试剂盒要求测定。在550nm处，测各孔的吸光度0D值。
[0052] (3).样品中HOP浓度的测定结果：轻脯氨酸含量（μ g/mL) = (测定管吸光度-空 白管吸光度）八标准管吸光度-空白管吸光度）乂标准管含量（5118/1^)水解液总体积 (mL)/取样量（mL)。实验结果见下表1所示。
[0053] 2. 4. 2血清中碱性磷酸酶（ALP)的含量测定
[0054] (1).基本原理：碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液 中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶 活力的1?低。
[0055] (2).测定方法：按试剂盒要求测定。在450nm处，测各孔的吸光度0D值。
[0056] (3).样品中碱性磷酸酶的测定结果：碱性磷酸酶（金氏单位/100mL) = (测定 管吸光度-空白管吸光度V(标准管吸光度-空白管吸光度）X酚标准品浓度（0. lmg/ mL) X lOOmLX样本测定前稀释倍数。实验结果如下表2所示。
[0057] 2. 4. 3股骨骨灰重系数测定
[0058] 大鼠右侧股骨在进行骨密度测定后，先置坩锅内于120°C干烤2h，取出，置干燥器 中保存，放置过夜。隔日，将烤干的股骨盛于坩锅内，置箱式电阻炉（马弗炉）中，分别在 250°C，400°C，600°C各加热0. 5h，最后于800°C灰化lh，取出，置干燥器冷却0. 5h，对骨灰称 重，实验结果见下表3。
[0059] 电子天平称量，骨灰重系数=股灰重（g) X 1000/大鼠体重（g)。
[0060] 2. 4. 4骨钙测定
[0061] (1).基本原理：钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝（MTB)结合，生成蓝色络 合物。通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙的含量。
[0062] (2).测定方法：按试剂盒要求测定。
[0063] (3).样品中骨钙的测定结果：实验结果如下表4所示。骨灰中钙的含量（mmol/ g)=(测定孔吸光度一空白孔吸光度）+ (标准孔吸光度一空白孔吸光度）X标准品浓度 (lmmol/L) +待测样本的重量（0. lg)。
[0064] 2. 4. 5骨磷测定
[0065] (1).基本原理：样品中的无机磷与钥酸作用生成磷钥酸，后者被还原成钥蓝，在 660nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出无机磷的含量。
[0066] (2).测定方法：按试剂盒要求测定。
[0067] (3).样品中骨磷的测定结果：实验结果如下表5所示。磷含量（mmol/g) = (测定管 吸光度-空白管吸光度V(标准管吸光度-空白管吸光度）X标准管浓度（〇. 5mmol/L) X 测试前稀释倍数（5) +骨灰浓度（0. lg/mL)。
[0068] 2. 4. 6股骨骨密度的测定
[0069] 分离出大鼠右侧股骨后，股骨标本经10%甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定 仪测定股骨的骨密度。股骨骨密度测定结果如下表6。
[0070] 2. 5统计学处理
[0071] 实验数据均采用均数土标准差（SD)来表示，组间差异显著性用t-test比较， p〈0. 05为有显著性差异。不同亚组之间采用SPSS15. 0统计软件进行数据处理。
[0072] 3.实验结果及结论
[0073] 3. 1实验结果
[0074] 表1大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对羟脯氨酸含量的影响
[0075]