专利名称:一种中药注射液致敏性的检测评价方法中药注射液是中药现代化发展中开发出来的一种现代中药制剂,临床使用疗效显著,广泛用于呼吸、心脑血管等领域,并取得了良好的市场经济效益。但是中药注射液在临床使用时经常有不良反应发生,具有安全隐患。临床经常使用的中药注射液品种,如双黄连、清开灵、板蓝根、鱼腥草、穿琥宁、脉络宁、葛根素、复方丹参等品种,均有不良反应报道。不良反应类型多样,最常发生的是药物性过敏。例如,双黄连注射液中金银花含有绿原酸、清开灵中的角类成分容易造成过敏。溶血反应也常见于中药注射液不良反应,例如 鱼腥草注射液中吐温-80超标容易引起溶血。此外,还涉及神经系统、消化系统、心血管系统、感觉器官、泌尿系统、皮肤及其附件等多个系统的不良反应。严重限制了该类品种的用药安全和新药开发。对于中药注射液中致敏性物质,有效的检验和检测方法对于控制其不良反应至关重要,但是当前尚缺乏高效灵敏的化学检测方法。因此,很有必要在现有技术的基础之上研究开发出一种可靠有效的中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药注射液中致敏性的不足,提供一种适用范围广泛,高效、稳定,操作方便、快捷,结果准确的中药注射液致敏性、刺激性的检测方法。技术方案为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为(I)使用截留分子质量为IKD至3KD超滤膜富集中药注射液中具有刺激性的大分子部位,备用;(2)将步骤(I)制备得到的刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中,共培养I至3天;(3)取步骤(2)培养后的单个核细胞采用台盼蓝染液染色或荧光染料染色,计数细胞的数目或功能状态来检测和评价中药注射液的致敏性。作为优选方案,以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法,步骤(I)中药注射液富集的倍数为I至10000倍,作为更优选的技术方案,本发明中药注射液富集的倍数为20至60倍。作为优选方案,以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法,步骤(2)刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中培养2至3天。本发明通过大量实验筛选刺激性的大分子部位在单个核细胞(PBMC)中培养时间,实验结果表明,当培养48至72小时小时,能够使单个核细胞在刺激性的致敏原下,细胞增殖达最高。作为优选方案,以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法,其中所述的单个核细胞PBMC细胞可以是人源或其它实验动物来源,可来自外周血液或脏器的免疫细胞。作为优选方案,以上所述的超滤膜可以使用工业超滤膜,也可使用商业的超滤离心管,中药制剂在生产和存放过程中可能产生微量的致敏物质,研究需要高浓度的致敏物质。而超滤是一种有效排除小分子干扰的技术,而且3KD的超滤管可截留并富集到高浓度致敏物,具有损耗小、效率高、操作便捷的优点。中药注射液制剂致敏性的检测方法是一个关键性的问题,本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法,创造性的采用单个核细胞PBMC激活为模型,PBMC细胞含有抗原递呈细胞,可识别并加工致敏原及类过敏原(如鞣质)与血清蛋白结合成全抗原的抗原信息,并递呈给PBMC中的T、B淋巴细胞。最后通过细胞数量或活力测定来评价注射液致敏物的刺激性,具有操作可靠性强,实验稳定性好等优点。本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法,由于富集的大分子部位有较深 的颜色,采用MTT法检测细胞活性有明显干扰,误差较大,实验结果不准确。本发明通过大量实验筛选,采用台盼蓝和荧光染色测定PBMC细胞活力;作为优选方案,荧光探针可以是Hochest, PI等多种荧光探针,优化的检测方法是用荧光显微镜或荧光酶标仪检测,具有检测灵敏,高效的优点。有益效果本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法和现有技术相比,具有以下优点本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法,通过大量实验,优选出大分子的富集倍数,创造性的采用单个核细胞PBMC为激活模型,并优选出大分子致敏性物质在单个核细胞PBMC中的培养时间,并采用优选的台盼蓝染液染色或荧光染料染色法来计数细胞的数目或功能状态,具有可操作性强,方便、快捷、高效、检测结果准确,可广泛适用与各种中药注射液,中间体等的致敏性的检测评价,克服了现有技术中致敏性的检测的诸多不足,本发明可为中药注射液的安全性评价,中药注射液的质量控制,为保证临床用药的安全性,提供科学的依据,具有重要的社会效应。显微镜观察。以中药注射液对细胞刺激性倍数来反映其致敏性的强弱。 刺激性倍数=(中药制剂组细胞数-对照组细胞数)/对照组细胞数二、结果对已知具有临床不良反应出现的成品进行20倍的超滤浓缩,采用上述建立的PBMC致敏性检测方法检测。结果表明,与正常对照组比较,已知出现不良反应的热毒宁(批号:100808、111011、101105、101114)均有显著的刺激性(**P < 0. 01),刺激倍数分别为2.4,3. 4,4. 03和2. 63。证明本发明提供的检测方法的准确性和可靠性。待测样品热毒宁(批号110709)对鼠PBMC未见有明显刺激性。而热毒宁(批号120207、120210、120211)均检测出有一定弱刺激性,具体实验结果如表I所示。表I临床出现不良反应的热毒宁和待检验热毒宁对PBMC刺激性(X土 s,n = 5)0,1大分子浓培养72小时后
本发明提供了一种中药注射液致敏性的检测评价方法,该方法是将中药注射液制剂经1至3KD超滤富集制备致敏性的大分子部位,然后将大分子部位加入到单个核细胞(PBMC)溶液中,共培养1至3天,然后采用优选的台盼蓝或荧光染料染色活细胞数目,以计算、评价中药注射液的致敏性强度。该方法具有方便、快捷和灵敏的优势,可广泛适用于各种中药注射液致敏性、刺激性的评价和检验,可为中药注射液的安全性评价,中药注射液的质量控制,为保证临床用药的安全性,提供科学的依据。
一种中药注射液致敏性的检测评价方法
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