专利名称：：依托咪酯在制备预防或治疗创伤后应激障碍药物中的应用的制作方法：创伤后应激障碍(Posttraumaticstressdisorder,PTSD)又称延迟性心因性反应(delayedpsychogenicreaction)，是由应激性事件或处境而引起的延迟性反应。导致产生PTSD的事件，是ー个人经历或目睹威胁生命的事件，这类事件包括自然灾害和人为灾害，如地震、严重灾害、战争、严重事故、被強暴、受酷刑、被抢劫等。PTSD可以共病焦虑、抑郁、物质依赖等多种精神疾患，也可以共病高血压、支气管哮喘等躯体疾病。PTSD患者的自杀危险性远远高于普通人群，高达19%。这是因为PTSD患者不但具有自身的独特的症状学特征，还常常伴有不同程度的焦虑、抑郁情緒，某些患者其严重程度甚至达到合并诊断情緒障碍的标准包括抑郁症、焦虑症等。据美国精神病协会(AmericanPsychiatryAssociation,ΑΡΑ)统计，美国PTSD的人群总体患病率为114%，平均为8%，个体终生患病危险性达358%，女性约是男性的2倍。总之，PTSD给个人、家庭、社会带来沉重的心理、生理和经济等方面的负担。美国精神病协会DSMIV(AmercianPsychiatricAssociation)对创伤后应激障碍(PTSD)的定义是经历过严重的创伤事件并具有以下的特征性症状持续1个月以上者(1)重新体验创伤事件，包括梦境中重现全部或部分。(2)回避与事件有关的任何刺激井出现广泛的麻木反应，表现为感觉麻木，情緒麻痹。(3)多种形式的情緒性及生理性喚起，各种形式的睡眠障碍最常见，也表现为作业困难，易激惹及紧张；灾难性事件的滞后和或延长反应导致稳态失衡和心身障碍。常见于残酷的战争、灾难事故、暴力伤害的身受或目击者；表现的症状为反复出现创伤体验，持续地警觉性增高或回避，也可表现为普遍性的反应麻木。从PTSD的定义可以得出PTSD的特点①长时间不能从创伤中恢复。②部分混乱的感官印象和凌乱片段的回忆，表现为反复“闪回”。③分离(dissociation)症状以及躯体化。这些现象是因为中枢神经系统对应激信息的记忆过程出现了障碍，使条件化的恐惧反应难于抑制或过分抑制所致。目前关于其产生机制研究结果包括以下方面一、脑内的记忆系统紊乱神经生理学和神经心理学的研究指出，高等哺乳动物脑内至少有两个主要的与记忆相关的系统一个系统与边缘系统为主要环节，与认知性记忆有关；另ー个系统以基底神经节为主要环节，与习惯的获得和适应性反应的记忆有关。这两个系统要进入运作状态均需要来自大脑皮层的输入，被感觉刺激激活的大脑皮层感觉区通常充当触发记忆启始的角色，从初级感觉投射区出发至少形成两条通路一条通向背侧，与额叶的运动系统相连接，另一条通向腹侧，与颞叶的边缘系统相连接。陈述性记忆的神经回路是视觉信号从视网膜经外膝体到达视皮层，在皮层视觉信号需经多级神经元的处理加工才能被识别。除初级皮层Vlタト，还要经V2，V3和V4等高级的视皮层的整合，再到颞叶以完成更为复杂的视觉信号的识别，然后经颞下回与边缘系统连接进入回忆回路。边缘系统主要包括外嗅和内嗅皮层、杏仁复合体、海马结构和旁海马回。这些内侧颞边缘结构直接发出投射到丘脑内侧核团，同时也可以经终纹的床核和乳头体间接投射到上述丘脑内侧核团。丘脑内侧核团再投射到额叶的腹内侧部分，包括眶额皮层，内侧前额叶以及扣帯皮层。边缘系统的这三个部分即内侧颞叶、内侧丘脑和腹内侧额叶是认知性记忆回路中三个关键性环节。在猿猴上的试验结果证明，损坏其中ー个环节，动物即不能完成带有认知性记忆的任务操作。边缘系统的这三个部分又是通向基底前脑胆碱能系统的间门，而基底前脑胆碱能系统被认为是另ー个对认知性记忆十分重要的脑结构。胆碱能系统与边缘系统有双向的联系，并可投射到大脑皮层的广泛区域，这样就形成了一个陈述性记忆的神经回路。在这个记忆回路中，丘脑是外界感知信息进入大脑的间ロ；杏仁体是边缘系统的一部分，与情緒的加工处理和回忆有关。在这里，信息的“重要性”将被评估，并由此激发焦虑、逃跑、抗争等等情緒和行为；海马也是边缘系统的一部分，负责与时间和空间有关信息的摄取和回忆。W.J.JacobsandJ.Metcalfe运用“热系统/7令系统(Hotsystem/Coolsystem)"来解释应激压カ状态下的记忆工作模式，“冷整合系统”指海马记忆系统的记录和拷贝是客观的，程序化的以自我传记的形式进行空间和时间的储存；它的整合是完整的、中立的、信息化的，易于控制的程序，且是整体的。相反，“热整合系统”指杏仁核则是直接的，快速，非常情绪化且不可逆转，碎片状；其记忆是被刺激驱使且完全是ー种重温的迹象，就象简单的回应。DeKloet等研究指出热系统/冷系统对于越来越増加的应激反应是不同的在低水平的应激反应时，在海马的盐皮质激素受体产生增加适应应激反应，但在高水平的应激反应时，糖皮质激素受体的连续占有盐皮质激素受体的结合点导致海马变得不反应，甚至在更高的应激反应时变得功能紊乱；而热系统对于不断增加应激反应，表现为简单的反应增加。因此，在创伤压力水平下，冷系统变得功能紊乱而此时热系统变的高反应，这就意味着内在编码在这种条件下变得碎片状，而不是空间时间的整合，充实完整和连贯的。ニ、记忆的印痕与中枢神经系统的突触可塑性(LTP)研究表明，正常的记忆印痕形成和学习与长时程突触增强(LTP)有关。在海马的传人纤维及海马的内部环路主要形成三个兴奋性突触连接系统来自眶回的前穿质(perforantpath,PP)ヰ海马齿状回的CA4颗粒細胞；颗粒细胞发出的苔状纤维(mossyfiber)-CA3锥体細胞；CA3锥体细胞发出的khaffer侧支ヰCAl锥体細胞。研究发现；在CA4，CAl和CA3神经元附近记录到按刺激強度分级的诱发电位，形成LTP。诱导LTP的两个主要因素是强直刺激的频率和強度，一定強度的刺激可提高单个刺激引起的EPSP的幅度，而一定频率的刺激可使EPSP产生叠加效应，作用的结果使突触后膜的去极化达到一定程度，使位于NMDA受体通道内阻止Ca2+内流的Mg2+移开，这样当递质与NMDA受体结合后，通道打开，Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，继后触发一系列生化反应，改变膜的性质，导致LTP产生。而患者在强的应激状态下，会导致海马内Ca2+超载，从而引起应激状态下的不易消退的长时效应或突触形态改变，进而导致创伤性记忆的障碍。三、神经内分泌功能紊乱下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamicpituitaryadrental，HPA)轴糸统在应激反应调控中有重要作用。促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasingfactor,CRF)是调节哺乳动物应激所致内分泌，自分泌和行为反应最重要的神经调质之一。Bremner等通过对比检验患者与正常对照人群脑脊液CRF含量发现，PTSD患者体内存在HPA轴神经内分泌调节功能紊乱。^huda等发现PTSD与其他应激个体有以下不同①皮质醇的低水平(PTSD的患者可的松水平在尿液和唾液中明显减低)，②糖皮质激素受体的敏感性増加，③较强的负反馈抑制，④下丘脑-垂体轴的各系统变得愈来愈敏感。另外^huda又发现PTSD患者及其后代的可的松水平均成较低的水平。糖皮质激素系统在HPA轴调控中亦有重要作用，其中皮质醇可能有明显的抗“应激”效应。^huda等研究表明，PTSD患者M小时尿平均皮质醇含量明显減少，血浆基础皮质醇水平降低，淋巴細胞内糖皮质激素受体数目増加，地塞米松抑制实验显示患者HPA轴负反馈抑制作用增强。在整体的应激心理神经内分泌反应中，肾上腺糖皮质激素是认知状态下ー个客观变化指标，在急性应激和慢性应激状态下，糖皮质激素水平都明显提高。海马内比其他脑区集中了更高浓度的肾上腺糖皮质激素受体，即I类盐皮质激素受体(MR)和II类糖皮质激素受体(MR)，因此也是对应激过程特別敏感的ー个脑区。当肾上腺糖皮质激素受体与多数肾上腺糖皮质激素结合，II类糖皮质激素受体和极少数结合。而当机体处于应激反应的状态下，肾上腺糖皮质激素的循环浓度提高，II类糖皮质激素受体的结合得到加强。电生理研究发现，I类盐皮质激素受体可以通过增加长时程增强效验(LTP)而增加海马神经可塑性。而II类糖皮质激素受体对LTP起相反作用。因此，长时期应激引起的肾上腺糖皮质激素浓度持续释放，或者长期接受肾上腺糖皮质激素的处理，能导致海马容量減少，海马CA3区树突萎縮，顶树突结构发生改变、大量锥体细胞变薄和脱落，还发现齿状回颗粒細胞的神经发生受到抑制。一般来说，依赖海马的认知功能失调的量和肾上腺糖皮质激素的急性影响之间呈倒U型关系，慢性应激引起糖皮质激素持续增高引起海马基因表达异常，导致学习和记忆的能力受损。药物治疗是PTSD的重要治疗手段之一。虽然目前用于PTSD治疗的药物较多，但几乎没有预防的药物。另外，大多数是对症治疗药物，缺乏针对以上三个发病环节的对因治疗药物，且副作用犬。如苯ニ氮卓类抗焦虑药、抗抑郁药、非典型抗精神病药、抗惊厥药等。早期一线药物主要以三环类抗抑郁剂(TCAs)和苯ニ氮卓类等为主，近10多年来被副反应相对较少的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类(SSRIs)取代。但是通过美国FDA认证的抗PTSD药物只有两个帕罗西汀(paroxetine，商品名I^axil)和舍曲林(sertraline，商品名Zoloft)ο依托咪酯(etomidate)的化学式为(+)-1_(1_苯乙基)-IH-咪唑_5_羧酸乙酯(ethyl3-[(IR)-1-phenylethyl]imidazole-4-carboxylate)，乙II^Hit甲；^中丰及胃溶解，在水中不溶，在稀盐酸中易溶。依托咪酯作为ー种短效、非巴比妥类静脉麻醉诱导药物，能够降低脑血流和脑耗氧，对呼吸、循环系统影响很小，体内代谢与清除均较快，具有极宽的安全剂量范围，作为麻醉诱导剂广泛应用于临床。截至目前为止，未见任何依托咪酯用于防治PTSD相关性焦虑和抑郁的相关报道。
本发明的目的是提供依托咪酯在制备预防或治疗创伤后应激障碍药物中的新用途。本发明在动物模型上首次测试ロ服经胃给药预防和治疗PTSD相关性焦虑和抑郁的药效学、药代学和安全性评价，发现依托咪酯具有显著降低应激引起的肾上腺皮质激素水平升高，改善慢性应激造成的焦虑和抑郁等作用。依托咪酯预防和治疗PTSD相关性焦虑和抑郁药理作用的机理尚不十分清楚，但本发明相关的药理学研究结果显示(1)通过未知的作用机理改善下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴负反馈抑制应激性失调，可逆性抑制应激性肾上腺皮质激素水平异常持续升高的作用，进而保护肾上腺皮质激素水平异常持续升高所造成的脑神经細胞损伤和突触功能损坏；(2)通过未知的分子与細胞机理逆转下调的脑内糖、盐皮质激素受体的表达水平；(3)在脑应激早期可能发挥替代中枢Y-氨基丁酸(GABA)的作用与GABAA受体直接结合引起效应或间接地作用于GABAA受体而增强GABA能的作用，这些作用可以挽救脑应激早期出现的兴奋性突触传递过强而抑制性突触调节功能减弱的突触稳态失调问题。本发明的实验基础是应用模拟PTSD的慢性不可预见应激(chronicunpredictablemildstress,CUMS)动物试验模型及束缚应激试验动物模型(Restraintstress)，在动物接受应激刺激开始之日起连续4-8周ロ服经胃给予依托咪酯可以显著降低应激引起的肾上腺皮质激素水平升高，改善慢性应激造成的焦虑、抑郁等动物行为学异常，而对照组无相应改善作用。每天分别在不同组大鼠经ロ灌胃给予依托咪酯(2，6，15，30mg/kg体重)，持续4_8周，定量观察试验资料的各项指标，发现(1)在开放旷场行为学测试中，依托咪酯给药组未出现在慢性应激组所观察到的行为学焦虑与抑郁表现，提示该药具有显著改善慢性应激造成的焦虑、抑郁等病理症状；(2)运动协调功能实验结果显示与正常组相比，给药组与对照组相比无统计学差异，证明不影响大鼠的运动协调能力。(3)水迷宫结果发现慢性应激后大鼠学习能力下降，而合适的依托咪酯剂量组与对照组相比，学习与记忆能力不受影响。(4)ELISA检测结果显示，依托咪酯给药组未出现在慢性应激组所观察到的ACTH、皮质酮和醛固酮含量持续增高现象；(5)Western免疫印记试验检测结果显示，依托咪酯给药组可以翻转慢性应激组动物海马等脑区肾上腺糖和盐皮质激素受体表达水平下降并恢复正常；(6)脑片电生理记录结果显示，依托咪酯给药组可以完全翻转慢性应激动物海马LTP消失和LTD持续延长现象。以上结果提示，依托咪酯可以通过抑制慢性应激造成的肾上腺糖和盐皮质激素水平异常增高来调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴负反馈抑制紊乱；通过某个尚不清楚的脑保护机制恢复糖和盐皮质激素受体在脑内的正常表达水平，抑制突触可塑性(LTP和LTD)异常，改善动物因应激性脑功能异常而产生的焦虑和抑郁，达到预防与治疗作用。通过行为学Morris水迷宮试验、Rota-Rod运动协调试验、位置偏爱试验等，持续8周的经ロ灌胃依托咪酯处理对动物的学习记忆、运动协调等无不良作用，与吗啡比较无药物依赖性作用。持续给药无显著药物耐受作用。通过血液肝肾功、血液常规、尿便代谢物、骨髓涂片、大鼠各器官组织(心、肺、肝、脾、胰腺、脑、肾上腺、睾丸、附睾)称重、大鼠各器官组织病理学切片染色等检查，除个别动物出现肾小管出现蛋白管型之外，未见其它异常，提示连续8周给药安全性好。8周的组织病理学检测结果显示，该药无致癌和致病作用。具体实施例方式本发明公开了依托咪酯在制备预防或治疗创伤后应激障碍药物中的新用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，通过适当改进エ艺參数而实现该发明。特別需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明之内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技木。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进ー步的详细说明。实施例1依托咪酯防治PTSD相关焦虑与抑郁的评价方法与药效学一、主要方法(1)慢性不可预见应激模型每只大鼠接受6-8周的随机刺激，包括冰水游泳G°C，5min)，热水游泳(48°C，5min)，禁食(48h)，禁食禁水(Mh)，350ml水倒入笼内锯末内，昼夜颠倒04h)，夹尾及摇晃Omin)，电击足底G5V电压电击k，间歇k，共进行30min)，水平震荡(5min)、41°C高温环境(5min)。每日进行1种刺激，1周内同种刺激不连续出现。(2)束缚应激试验模型单笼饲养，每天给予大鼠束缚他，束缚期间禁食禁水，模型建立时间为3W。(3)CUMS动物试验模型和束缚应激试验模型两组动物，随机分配到依托咪酯干预组和对照組，定量观察动物食欲，体重，探洞开放联合旷场行为学试验，Rota-Rod运动协调能力试验，Morris水迷宫空间学习记忆试验，海马等脑区突触电生理学记录实验，脑内肾上腺糖和盐皮质激素受体表达水平，血液ACTH、糖、盐皮质激素水平等生化和分子标示物检测寸。ニ、主要结果建立慢性应激动物行为学、突触电生理学和应激血液脑生化评价指标(1)发现慢性应激后大鼠在1周左右出现显著焦虑行为，表现为不安，胆小，探査行走行为异常增多；2周后表现为持续抑郁，动物体重减轻(表1)，感觉迟钝，表现淡漠，探究和行走行为显著減少，偏爱角落萎縮(表幻，观察至8周无明显改善。(2)被试动物Rota-Rod运动协调能力试验未发现与对照组有何异常，即不同条件应激后不影响大鼠的运动协调能力(表3)。(3)Morris水迷宫空间学习记忆试验结果显示慢性应激后大鼠的学习记忆能力较对照组显著下降(表4)。(4)用ELISA检测发现，慢性应激组大鼠血浆中的ACTH、皮质酮和醛固酮含量持续增高，而对照组动物以上指标无显著改变(表5)。(5)用Western免疫印记试验显示慢性应激组动物海马等脑区肾上腺糖和盐皮质激素受体表达水平显著下降(表6)。(6)用脑片突触电生理学记录技术研究发现，慢性应激动物海马内嗅区-齿状回和内嗅区-海马CAl突触传导通路的条件性长时程增强效应(long-termpotentiation,LTP)消失，而条件性长时程压抑效应(long-termdepression,LTD)持续延长，提示两个普遍被认可能够反应脑内正常突触可塑性的生理指标发生显著异常(表7)。依托咪酯防治PTSD相关焦虑与抑郁药效学评价把以上(1)-(6)的行为、病理生理和生化指标作为评价依托咪酯防治PTSD相关焦虑与抑郁药效学的定量指标，对正常对照组、束缚应激模型組、慢性不可预见应激模型组和依托咪酯组大鼠的食欲，体重，探洞开放联合旷场行为学试验，Rota-Rod运动协调能力试验，Morris水迷宫空间学习记忆试验，海马等脑区突触电生理学记录实验，脑内肾上腺糖和盐皮质激素受体表达水平，血液ACTH、糖、盐皮质激素水平等生化和分子标示物检测等进行定量观察。以上实验结果显示慢性应激致下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴负反馈抑制失调，造成肾上腺皮质激素水平持续增高，导致脑内多个部位肾上腺皮质激素受体表达下降和海马突触可塑性损害，应用依托咪酯可逆转下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴负反馈抑制失调，预防和治疗慢性应激造成的脑功能障碍，改善PTSD相关的焦虑和抑郁行为学症状(具体结果见表1-7)。8权利要求1.依托咪酯在制备预防或治疗创伤后应激障碍药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药领域，公开了依托咪酯在制备预防或治疗创伤后应激障碍药物中的应用。本发明在动物模型上进行口服经胃给药预防和治疗创伤后应激障碍相关性焦虑和抑郁的药效学、药代学和安全性评价，证实依托咪酯可以使应激引起的肾上腺皮质激素水平升高恢复正常水平，逆转应激导致的海马等脑区肾上腺皮质激素受体表达水平下降和海马突触可塑性异常，改善慢性应激造成的焦虑和抑郁的作用。文档编号A61P25/24GK102579433SQ20111000828公开日2012年7月18日申请日期2011年1月14日优先权日2011年1月14日发明者吕卓敏,尚刚伟,李春丽,李震,杨帆,王应莉,王晓亮,王燕,陈军申请人:海南际中博远实业发展有限公司