专利名称：蒽环类药意外外渗的治疗方法图1)。也即，它们可诱捕这些可切割复合物，从而将必需的拓扑异构酶II酶转变成致死酶(2)。拓扑异构酶II催化抑制剂是完全不同的一组药物。它们通过干扰整个催化功能起作用，这可以通过至少两种方式完成。一是抑制拓扑异构酶II和DNA的初始结合，如氯喹(3)和阿柔比星(4，5)的情况。另一种方式是在重新连接后将拓扑异构酶II锁在其闭合夹子步骤中，正如ICRF-187和其类似物(6-9)所表现的情况。蒽环类药蒽环类药包括一组广泛采用的在许多恶性疾病中具有活性的细胞毒化合物。柔红霉素，19世纪70年代早期发现的第一个蒽环类药抗生素，它是从链霉菌属(Streptomyces)的培养物中分离的。此后不久，多柔比星被提取出来并进行了临床研究。这两个药物具有广泛的抗恶性疾病的活性-柔红霉素主要用于血液恶性病领域，而多柔比星主要用于对抗实体瘤。表柔比星是多柔比星的立体异构体，具有相同的适应症，但与母体药物相比效力稍弱而心脏毒性较小。伊达比星(4-去甲氧基柔红霉素)与柔红霉素相似，但在C-4位置缺少甲氧基。它比其它的蒽环类药化合物具有更大的亲脂性，而且更容易透过血脑屏障。这些药物的作用机制并不十分清楚。其抑制细胞核酶DNA拓扑异构酶II的能力解释了该抗肿瘤作用。因此，蒽环类药被归为拓扑异构酶II毒药。然而，这些药物还与其它酶例如拓扑异构酶I、DNA及RNA聚合酶和解螺旋酶相互作用。而且，它们能嵌入DNA，该过程可以引发自由基损伤。在蒽环类药的细胞内代谢过程中，蒽醌核心被转化成可以造成局部DNA破坏的自由基半醌中间物。而且，蒽环类药能够螯合铁并与DNA形成三重复合物。然而，诱导自由基DNA破坏所必需的该药物浓度比可获得的临床浓度高。因此，该机制对于抗肿瘤作用而言似乎不太重要。蒽环类药治疗的最显著副作用是意外外渗后出现的心脏毒性(10，11)、血液毒性、胃肠毒性、和极严重的局部毒性(见下文)。ICRF-187双二氧哌嗪ICRF-187(右雷佐生)是雷佐生(ICRF-159)的水溶性(+)对映异构体。它是高度特异的拓扑异构酶II催化抑制剂。人们提出一个假说ICRF-187作为阳离子结合物EDTA的类似物通过结合铁并由此使铁与氧隔离而防止了自由基破坏(2)。然而，近来我们阐明，对ICRF-187具有获得性抗性的细胞在拓扑异构酶IIα(拓扑异构酶II的一种亚型)中带有突变，这些突变的位置与拓扑异构酶II毒药例如柔红霉素和依托泊苷诱导的位置不同。我们在酵母中采用人源化拓扑异构酶II证实这些突变是有功能的(13，14)。因此，当我们提出ICRF-187是一种特异的拓扑异构酶II药剂时，我们的假设是正确的。我们已阐明，可以在该酶催化周期的2个不同步骤消除依托泊苷、柔红霉素和伊达比星引起的细胞杀伤(也见图2)。因此，嵌入药物如氯喹抑制该酶达到其靶标(3，15，16)，而双二氧哌嗪ICRF-187将该酶锁定在闭合夹子步骤(4，17，18)。ICRF-187被注册为对抗蒽环类药诱导的心脏毒性的心脏保护剂(Zinecard?，Cardioxane?)。蒽环类药的外渗估计在所有接受化疗的患者中有0.6-6％发生意外外渗。化疗剂例如与DNA结合的蒽环类药尤其易于在外渗时引起严重的组织破坏。该组织损伤可能在几天或甚至几周内不表现，而且可能由于药物再循环至邻近组织中可以持续数月恶化。该局部毒性的特征在于在外渗位置出现急性疼痛、红斑和肿大，并且通常发展成溃疡。事实上，已阐明，蒽环类药例如多柔比星能够在组织中维持至少一个月(20)。尽管小的溃疡有时可以治愈，但大的溃烂需要手术切除以缓解疼痛和抢救基础组织。因此，早期对涉及的区域进行大范围的清除，之后进行皮肤移植，这种手术方法成为一种首选的治疗方案(21)。在最近20年中，对许多可能的治疗形式进行过研究。持续1小时-3天或更长时间用冰进行局部冷冻是一种广泛采用的治疗方案(22)，该方法应立即开始。将局部注射或体表施用皮质类固醇用作一种抗炎症的治疗方案在动物和人类研究中产生了矛盾的结果(23)。炎症似乎不是此病理生理学的部分，而且皮质类固醇甚至可以恶化这些损伤。正如局部施用硫代硫酸钠、透明质酸酶(25)和β-肾上腺素能药物(拮抗剂和激动剂)(26)一样，局部施用碳酸氢钠(24)的作用在实验研究中产生不同的结果。用含有或不含α-生育酚(维生素E)的二甲基亚砜(DMSO)进行体表试验处理或临床应用2-7天(27-29)，在动物和不受控的临床研究中均表现出(至少是DMSO)良好效果。然而这些结果并不统一。在一个研究中，在大鼠中用α-生育酚、银杏(Ginkgo biloba)提取物、或己酮可可豆碱对皮内(ID)多柔比星进行腹膜内(IP)表面治疗，降低了丙二醛的组织水平，由此提示清除了自由基(29)。体外二(3，5-二甲基-5-羟甲基-2-氧代吗啉-3-基)(DHM3)可以和多柔比星反应，产生无活性的代谢物脱氧多柔比星苷元，并且在猪中用DHM3损伤内治疗ID多柔比星外渗已表现出一些益处(30)。但自1988年以来一直没有验证性的研究公开。
在几乎所有的动物研究中，蒽环类药都是经皮内注射的。已证明，在啮齿类动物的皮肤肌肉层内膜下注射易于引起不规则的溃疡损伤，而皮内注射产生均一的皮肤坏死和溃烂(32)。然而，蒽环类药的ID注射也已是在猪模型中研究过的方法。
多柔比星和表柔比星外渗的冰冻切片荧光观察已被声称是一种检测组织中残余药物的有效方法，该方法可以充当浸润手术治疗的指导(31，33)。
在兔模型中已对这些组织学改变进行过研究，其中最早的改变包括血管闭塞和胶原的渐进性坏死。从未发现炎性细胞起到主要作用(34)。在大鼠的坏死真皮中观察到未知病因的小泡(32)。对于细胞凋亡一直未进行过研究。
发明简述从未公开过关于ICRF-187、其它的双二氧哌嗪或拓扑异构酶II催化抑制剂作为一种备选治疗方案的研究。而且，已公开的研究或综述均没有对拓扑异构酶II酶作为蒽环类药或其它拓扑异构酶II毒药外渗的解毒剂的潜在靶标进行过讨论。最后，已有大量的动物实验涉及皮内外渗antracycline的局部治疗。我们的意见是皮下施用最接近临床现实。而且，正如这些实例已阐明的，损伤面积×时间(曲线下面积，AUC)是一个重复性非常好的参数。
由于进入中心静脉的装置的应用增加，局部治疗相对系统治疗的问题是非常重要的。当预期在一个长期过程中有多次输注时，应考虑放置带有长留置线的皮下贮器。在蒽环类药治疗中情况常常就是这样。放置短期和长期留置中心静脉导管目前已成为对癌症患者实施的一项普通手术操作。然而，这些装置并非没有渗漏、渗滤(displanement)问题，或引起感染性血栓症。已经报道有6.4％的外渗发生率(35)。很明显，治疗来自于中心放置的留置装置的局部外渗是困难的。在这样一个状况下，系统治疗适合得多，但直到目前还没有这种方法。
图2显示了切割一条DNA片段(G)并使另一条DNA片段(T)通过所需要的拓扑异构酶II可能的结构和催化周期。拓扑异构酶II毒药在第3-4阶段切割片段时起作用。催化抑制剂或在第1阶段(氯喹和阿柔比星)或在第5阶段(ICRF-187)起作用。
图3显示了从实施例2获得的结果。
图4显示了实施例4的结果。
图5显示了实施例6的结果。
图6显示了实施例9的结果。
图7显示了实施例11的结果。来自7个独立实验的曲线下平均面积(AUC)，其中当t＝0时，柔红霉素3mg/kg SC+/-ICRF-187 250mg/kg IP。□＝无ICRF-187；●＝有ICRF-187；…＝平均值；杆状条＝SEM。
图8A显示了实施例11的结果。在SC注射3mg/kg柔红霉素后，不同ICRF-187方案的平均AUC。
图8B显示了实施例11的结果。在SC注射0.75mg/kg伊达比星后，不同ICRF-187方案的平均AUC。
图8C显示了实施例11的结果。在SC注射2或3mg/kg多柔比星后，不同ICRF-187方案的平均AUC。
图9显示了实施例11的结果。左图散点图，显示经SC施用3mg/kg柔红霉素后t＝0时IP施用盐水(O；n＝56)或IP施用ICRF-187 250mg/kg(●；n＝55)获得的各个小鼠的AUC分布。水平线指示平均AUC。
右图左图相同数据的平均损伤面积相对时间作图。
DEX右雷佐生＝ICRF-187；AUC曲线下面积。
图10显示了实施例11的结果。左图散点图，显示经SC施用2或3mg/kg多柔比星后t＝0时IP施用盐水(O；n＝56)或IP施用ICRF-187250mg/kg(●；n＝55)获得的各个小鼠的AUC分布。水平线指示平均AUC。
右图左图相同数据的平均损伤面积相对时间作图。AUC的差异十分明显。
DEX右雷佐生＝ICRF-187；AUC曲线下面积。
发明详述本发明通过采用拓扑异构酶II催化抑制剂例如双二氧哌嗪ICRF-187提供一种有效的系统和/或局部治疗拓扑异构酶毒药例如蒽环类药柔红霉素、多柔比星、表柔比星、和伊达比星意外外渗的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及在接受拓扑异构酶II毒药治疗，通常是系统治疗的患者中预防或治疗由包括蒽环类药在内的拓扑异构酶II毒药引起的组织损伤的方法。该方法包括向有此需要的患者施用拓扑异构酶II催化抑制剂。拓扑异构酶II毒药可能外渗的迹象通常是来自外渗区域的急性疼痛，籍此可以相应地开始抗组织损伤的治疗。然而，在外渗发生后，组织损伤可以持续一个长的时期，因此可以以确保对组织损伤的最佳抑制所必需的频度反复用拓扑异构酶II催化抑制剂进行治疗。
根据本发明的拓扑异构酶II抑制剂优选选自双二氧哌嗪；喹啉；阿柔比星；和吖啶。优选的双二氧哌嗪是ICRF-187(右雷佐生)。然而，本发明所涉及的双二氧哌嗪化合物包括具有通式I所示结构的双(3，5-二氧哌嗪-1-基)链烷
其中R1和R2独立地选自氢和任选取代的C1-6-烷基，或R1和R2与间隔原子一起形成C3-8-碳环，而且其中R3和R4选自氢和任选取代的C1-6-烷基。
在本文中，术语“C1-6-烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或分支饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、环己基。
在本文中，术语“C3-8-碳环”是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。应当理解，当R1和R2与间隔原子一起称作“C3-8-碳环”时，该二氧哌嗪环可以相对于该碳环以反式(E)或顺式(Z)与之结合。还应理解，该碳环本身可以被选自C1-6-烷基、C1-6-烷氧基(＝C1-6-烷基氧基)等的1-3个基团取代。
在本文中，术语“任选取代的”是指所述的烷基基团可以被一或多个选自以下的基团1-3次取代C1-6烷氧基、氧(可以表示为互变异构的烯醇形式)、羧基、氨基、羟基、单和双(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和双(C1-6-烷基)氨基羰基、卤素(即氟、氯、溴和碘)、苯基或杂环基(例如哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯啉、吡咯烷、吡唑啉、咪唑啉)。
在一个目前的优选实施方案中，取代基R1、R2、R3和R4的含义包括如下组合，其中R1和R2选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基甲基和乙氧基甲基，而R3和R4与以上一般定义的相同，然而优选选自氢和甲基。
在另一优选实施方案中，取代基R1、R2、R3和R4的含义包括如下组合，其中R1和R2与间隔原子一起是环丙基、环丁基或环戊基环，而且R3和R4与以上一般定义的相同，但优选选自氢和甲基。
在再一优选实施方案中，取代基R1、R2、R3和R4的含义包括如下组合，其中R3和R4选自氢、甲基和杂环基取代的甲基，杂环基例如哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯啉、吡咯烷、吡唑啉和咪唑啉，而R1和R2与以上一般定义的相同，然而优选选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基甲基和乙氧基甲基，尤其是甲基。
在再一优选实施方案中，取代基R1、R2、R3和R4的含义包括如下组合，其中R1和R2选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基甲基和乙氧基甲基，而R3和R4是氢。
应当理解，R1和R2取代基可以导致光学活性形式(即(S)和(R)型)或这些形式的外消旋混合物。
R3和R4是氢的尤其优选的组合是R1＝R2＝氢、甲基(内消旋)、乙基(内消旋)的组合，R1＝氢而R2＝甲基(外消旋，(S)-(+)(右雷佐生)或(R)-(-)(levrazoxane)，优选(s)-(+))和乙基的组合，以及R1＝甲基而R2＝乙基、丙基、异丙基和甲氧基甲基，而且后者为赤型或苏型，优选赤型的组合。
拓扑异构酶II催化抑制剂的施用可以是局部施用给拓扑异构酶II毒药外渗所影响的组织。这包括注射至该区域中，通过或采用任何形式的植入物、包含在敷料中、在其它任何适合的途径上喷雾来施用该抑制剂。该局部治疗可以是唯一的治疗或对系统治疗的补充治疗。在外渗处于体腔例如胸膜内时局部治疗尤其有利。
在一个优选的实施方案中，拓扑异构酶II催化抑制剂的施用方式是给受到拓扑异构酶II毒药外渗影响的组织进行系统给药。本发明的一个非常重要的方面是，该组织损伤可以通过系统给药得到预防或治疗，因为该系统治疗保证了该抑制剂达到组织损伤部位。
很明显，该抑制剂的施用通常是在外渗成为事实，或据信已发生外渗后开始。然而，在某些情况下，可以优选开始预防性治疗。这可以是以下情况患者在较早的拓扑异构酶II毒药治疗中已遭受过外渗，或有一定的外渗危险例如患者的血管非常脆弱(在接受化疗的患者中这是极为常见的)。
在一个优选的实施方案中，拓扑异构酶II催化抑制剂在采用拓扑异构酶II毒药治疗之后施用。在一个更优选的实施方案中，该抑制剂在用拓扑异构酶II毒药治疗之后施用，而且只要该组织仍含有拓扑异构酶II毒药或其活性代谢物就持续施用。在这种情况下，采用该抑制剂进行的治疗可以依据组织损伤的部位和程度间隔实施。因为主要问题是保证只要在所述组织区域中毒药仍具有活性，在该相关区域就有该抑制剂存在，所以本领域技术人员根据本发明信息将能够提出基于个体情况的相关具体治疗方案。
可以引起组织损伤并可以根据本发明进行治疗的拓扑异构酶II毒药包括依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、替尼泊苷、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、m-AMSA和蒽环类药。而且，当该细胞核酶拓扑异构酶II已在DNA中产生了可切割的复合物后抑制该酶的重新结合步骤的任何拓扑异构酶II毒药均包括在本发明范围内。
一般说来，没有理由在该毒药之前过早施用，因此最优选在需要预防治疗时，与拓扑异构酶II毒药给药基本上同时皮下施用该抑制剂。
当在该拓扑异构酶II毒药给药之后施用拓扑异构酶II催化抑制剂时，一般应在该拓扑异构酶II毒药给药后3周之内进行，例如在施用该拓扑异构酶II毒药后2周之内、优选1周之内、更优选5天之内、甚至更优选3天之内、甚至更优选1天之内进行。该3周时间可以说明该毒药或其代谢物在患者中仍具有活性的情况。
一般地，应在施用拓扑异构酶II毒药后18小时内施用该拓扑异构酶II催化抑制剂，例如在施用该拓扑异构酶II毒药后12小时内、优选6小时内、更优选4小时内、甚至更优选2小时内、甚至更优选1小时内施用，以防止发生由外渗引起的组织损伤。然而，由于其它原因，可能最为方便的是监测是否存在任何外渗，并尽可能快地用抑制剂治疗该患者。因此，在再一方面，根据本发明的方法涉及在知道或怀疑该拓扑异构酶II毒药外渗时施用拓扑异构酶II催化抑制剂的情况。
在一个优选实施方案中，施用该拓扑异构酶II催化抑制剂至少2个重复剂量，例如至少3个重复剂量。这些重复剂量可以一致，或是剂量逐渐减少。优选这些重复剂量从第一个剂量开始每隔1-3天、优选每隔2天、更优选每隔1天施用。然而，从拓扑异构酶II催化抑制剂的第一个剂量起，少于24小时的较小间隔，例如至多18个小时的间隔、更优选至多6小时的间隔，例如大约3个小时的间隔，已显示出令人惊奇的结果。这些间隔不必一致，因为递增间隔的治疗可能极为有利。技术人员将能够采用相对高的剂量或最小间隔的剂量及随后增加拓扑异构酶II催化抑制剂施用的间隔，估计出某种“饱和”的情况。
该拓扑异构酶II催化抑制剂应在知道或怀疑该拓扑异构酶II毒药外渗后12小时内，优选6小时内施用。应当注意，为了防止由可能的外渗造成的损伤，该施用可以作为一种常规手段进行。
在一个优选的实施方案中，该拓扑异构酶II催化抑制剂是双二氧哌嗪，而该拓扑异构酶II毒药是蒽环类药。目前，蒽环类药是造成最坏的组织损伤病例的原因。因此，蒽环类药选自柔红霉素、多柔比星、伊达比星和表柔比星的本发明方法是本发明极为重要的方面。
根据本发明的拓扑异构酶II抑制剂可以是具有以上所述式I的双二氧哌嗪，而且优选的双二氧哌嗪是ICRF-187(右雷佐生)。
由于本发明的具体情况，说明该抑制剂的确切剂量是非常困难的。然而，就ICRF-187而言，该药物的使用浓度和剂量可以从其它的医学指征已知，而且可以将该剂量用于根据本发明的方法中。在其它情况下，技术人员将能够尤其是通过使用递增剂量提出符合该毒药外渗的估计体积的相应剂量。一般，组织损伤的危险将增加抑制剂的副作用危险。采用本发明方法的目的是施用足以在组织中存在以预防或治疗组织损伤的拓扑异构酶II抑制剂量。正如实施例中所表现的，给女性患者施用1000-500mg/kg的重复剂量已获得成功的治疗。因此，根据本发明可以采用100-5000mg/kg的重复剂量。确切剂量取决于在具体情况下是优选单个剂量还是3个或更多个重复剂量。正如用小鼠和猪进行的实验中所指出的，在重复剂量中少得多的25mg/kg的剂量获得了极为良好的效果。因此，相似的剂量属于本发明的范围。
再一方面，本发明涉及拓扑异构酶II催化抑制剂在制备如下药物中的应用，其中该药物用于治疗或预防接受拓扑异构酶毒药治疗，例如系统治疗的患者中由于该拓扑异构酶毒药外渗造成的组织损伤。因此，本发明涉及拓扑异构酶II催化抑制剂在制备用于任一本文所述方法的药物中的应用，在本文中，“用拓扑异构酶药物进行的治疗”是指正在进行的治疗(例如接受了具体治疗方案的患者)或已接受了治疗的患者。
本发明还涉及用于在接受包括蒽环类药在内的拓扑异构酶II毒药系统治疗的患者中预防或治疗由该药物外渗引起的组织损伤的药物盒，所述药盒含有a)一个剂量单位的拓扑异构酶II毒药和任选的可药用载体，和b)一个剂量单位的拓扑异构酶II催化抑制剂和任选的适用于局部或静脉内给药的可药用载体，以及任选的c)在外渗情况下给患者提供该拓扑异构酶II催化抑制剂的说明书。
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于在接受蒽环类药系统治疗的患者中预防或治疗由蒽环类药外渗引起的组织损伤的药物盒，所述药盒含有a)一个剂量单位的蒽环类药和任选的用于静脉内给药的可药用载体，和b)一个剂量单位的双二氧哌嗪和任选的适用于局部或静脉内给药的可药用载体，以及任选的c)给患者提供该拓扑异构酶II催化抑制剂双二氧哌嗪的说明书，以便在外渗情况下施用该双二氧哌嗪。
该药盒可以包括活性成分的任何相关溶剂，和该抑制剂局部和/或系统使用的说明书。
在一个优选实施方案中，该药盒仅含有本文提及的拓扑异构酶II催化抑制剂之任意一种，而不含拓扑异构酶II毒药。
该药盒优选地用作应该在外渗可能发生时可以即刻获得的急救药盒。
本发明通过如下实施例作进一步阐述。
采用带有0.05ml固定体积储液管和27G×3/4”针头的Hamilton?注射器皮下注射蒽环类药药物。背部的松弛皮肤缩回后，注射位置在尾根部以上大约1cm处。
用27G×3/4”针头腹膜内注射大约0.2ml体积的ICRF-187。
当损伤内施用时，在用带有固体剂量储液管的Hamilton?注射器注射了0.05ml体积的蒽环类药后立即通过不同的皮肤穿刺注射ICRF-187。识别每只小鼠在耳上作标记用于辨别个体。观察用尺子每日测量损伤的两个最长的垂直直径。损伤定义为至少2mm2的组织损伤。愈合定义为损伤区域中毛发的完全再生。在所有损伤治愈后无痛处死小鼠。数据处理和统计学方法计算两个最长的垂直直径(单位mm)的乘积作为损伤的大小。计算每只小鼠的损伤面积乘以持续时间，即曲线下面积(AUC)。在以下部分中给出的数据表包含了平均AUC。采用Mann-Whitney检验比较AUC、损伤开始出现的时间、和损伤的持续时间。采用Fischers确切t检验比较溃疡率。缩写采用以下缩写AUC＝曲线下面积TTWW＝损伤开始出现的时间；未受损伤的小鼠除外DWW＝损伤的持续时间；未受损伤的小鼠除外NW/NG＝溃疡率SEM＝平均值标准误IP＝腹膜内SC＝皮下IL＝损伤内IV＝静脉内结果表述于实施例1的数据表中。用125mg/kg ICRF-187 IP进行治疗导致AUC从543mm2×天降低91％至48mm2×天(p＜0.05)。ICRF-187浓度增加至250和375mg/kg导致完全防止了损伤出现。溃疡率从86％分别降低至14％、0％和0％。由于ICRF-187治疗组中的损伤数量少，TTWW和DWW改变的统计学比较没有意义。没有治疗相关的死亡。
实施例2ICRF-187的时间选择在36只小鼠中研究ICRF-187的时间选择。与实施例1中的相同，多柔比星的浓度为2mg/kg，而盐水用作对照。分别在施用多柔比星的同时、3小时之后、或6小时之后，IP施用浓度为250mg/kg的ICRF-187。结果表述于数据表#2
用ICRF-187治疗导致AUC降低82-92％，即从458分别降至45、52和81mm2×天。与同时施用比较，当在多柔比星之后6小时实施治疗时，AUC降低较小，统计学上没有显著趋势。损伤的出现时间和损伤的持续时间是不同的。没有治疗相关的死亡。平均AUC图示于图3。
总体说来，实施例1和2中在t＝0时采用ICRF-187进行治疗使溃疡率从14/16降低至6/29，即从88％降低至21％(p＜0.05)。
施用ICRF-187导致在低和高剂量组中AUC分别降低100％和75％(p＜0.05)。同样，与组别1对2和3对4中ICRF-187对损伤平均持续时间的作用一样，在两个对照组(1和3)中AUC间的剂量依赖性差异是统计学上显著的。在接受1mg/kg柔红霉素的组中，溃疡率的降低同样是统计学上显著的，而在3mg/kg的组中观察到同样的趋势。尽管该差异不显著。
似乎实施例8中表柔比星的剂量较低。因此，将对较高剂量的表柔比星的效应作进一步研究。同样，还未进行关于相对表柔比星外渗ICRF-187施用时间的影响的研究。
在SC注射3mg/kg柔红霉素后立即给予一次IP注射250mg/kgICRF-187，降低平均AUC 70％(p＜0.0001)(图8和9)。带有损伤的小鼠比率从96％降低至78％(p＝0.0041)。在带有可检测到的损伤的小鼠中，损伤出现的平均时间延迟了76％，从5.5天延迟至9.7天(p＜0.0001)。而且，ICRF-187降低损伤平均持续时间35％，从26.6天降低至17.4天(p＜0.0001)。
对于多柔比星(图8和10)，SC施用2或3mg/kg后在t＝0时采用250mg/kg ICRF-187使平均AUC降低96％(p＜0.0001)。带有损伤的小鼠比率从77％降低至14％(p＜0.0001)，损伤持续时间缩短28％(p＝0.0035)。在损伤出现时间上没有延迟。
在柔红霉素和多柔比星所诱导的损伤中，IP注射ICRF-187比IV施用所提供的保护之间没有统计学显著差异。
柔红霉素剂量从3mg/kg降低至1mg/kg导致显著缩小的AUC(p＜0.0001)，损伤的频率、损伤的出现时间、或损伤的持续时间没有差异。在低剂量的柔红霉素时，用ICRF-187进行IP治疗也导致AUC的统计学上显著降低(p＜0.0001)。SC注射低于2mg/kg多柔比星不产生任何损伤。
在柔红霉素所诱导的损伤中，当ICRF-187的剂量从250mg/kg IP降低至125mg/kg时，AUC的减少从70％降低至45％(p＝0.0175)。相反，所有剂量的ICRF-187均一样有效地防止多柔比星损伤。
与t＝0时治疗所获得的效果相比，延迟3或甚至6个小时施用ICRF-187并不妨害防止多柔比星损伤的保护程度。相似地，在注射柔红霉素后3小时施用ICRF-187时，该保护作用与立即施用ICRF-187所获保护作用没有差异。然而，如果延迟6个小时，则丧失该保护作用。
连续三天采用IP ICRF-187 250mg/kg进行治疗，完全防止了多柔比星和柔红霉素所诱导的损伤。而且，在注射柔红霉素或多柔比星后第0、3和6小时IP施用62.5mg/kg或125mg/kg ICRF-187进行的三次处理，导致与单次IP注射250mg/kg ICRF-187至少相同的保护程度。
在ICRF-187和多柔比星于SC注射前混合的两个实验中，ICRF-187的剂量与保护损伤的作用呈负相关。SC注射30mg/kg ICRF-187和3mg/kg多柔比星的混合物完全预防了损伤的出现。然而，在同样体积中将ICRF-187的剂量增加至250mg/kg，在9只处理小鼠的7只中导致损伤出现。
图7显示了SC柔红霉素对损伤的诱导和IP ICRF-187对这些损伤的防护具有高度可重复性。平均曲线下面积(AUC)来自t＝0，柔红霉素3mg/kgSC+/-ICRF-187 250mg/kg IP时的7个独立实验。在处理(加ICRF-187；p＝＞0.05；Student-Newmann-Kents检验)或对照(无ICRF-187；p＝＞0.05)中实验间变异并非统计学上的差异。在所有实验中ICRF-187处理导致平均AUC的统计学降低(p＜0.001)。□＝无ICRF-187；●＝加ICRF-187；…＝平均值；杆状条＝SEM。
图8显示了防止柔红霉素所诱导的损伤比防止SC多柔比星所引起的损伤更具有剂量和时间依赖性。通过采用ICRF-187进行的三次处理获得的明显保护作用是十分令人惊奇的。该柱形图比较了分别SC注射3mg/kg柔红霉素(图8A)、0.75mg/kg伊达比星(图8B)、和2或3mg/kg多柔比星(图8C)后不同时间表施用ICRF-187产生的平均AUC。
平均AUC平均曲线下面积(mm2×天数)；n小鼠的数目；杆状条SEM。
图注除了代表盐水的柱条外，图注说明了ICRF-187的剂量、施用途径和时间选择。
图9显示了单次系统注射ICRF-187显著减少了SC柔红霉素所诱导的损伤。
左图散点图，显示SC施用3mg/kg柔红霉素及随后t＝0时IP施用盐水(O；n＝56)或IP施用250mg/kg ICRF-187(●；n＝55)后，各小鼠AUC的分布。水平线指示平均AUC。
右图左图同样数据的平均损伤面积对时间的作图。AUC之间的差异十分显著。而且，这些曲线揭示了损伤出现上的延迟和损伤持续时间的缩短。
DEX右雷佐生＝ICRF-187；AUC曲线下面积。
图10显示了单次系统注射ICRF-187显著减少了SC多柔比星诱导的损伤。
左图分散作图，显示SC施用2或3mg/kg多柔比星及随后IP施用盐水后(O；n＝56)，或t＝0时IP施用250mg/kg ICRF-187(·；n＝55)后，各个小鼠AUC的分布。水平线指示平均AUC。
右图左图同样数据的平均损伤面积对时间的作图。AUC之间的差异十分显著。
DEX右雷佐生＝ICRF-187；AUC曲线下面积。
表A小鼠中对SC柔红霉素、伊达比星和多柔比星诱导的损伤进行治疗的结果。如果不另行指出，则处理(ICRF-187或盐水)在t＝0时实施。
DEX右雷佐生＝ICRF-187；AUC平均曲线下面积(mm2×天数)；FW带有损伤的小鼠百分数(％)；TTW损伤出现的平均时间(天数)；DW损伤的持续时间(天数)；括号平均值的标准误，SEM；*集合的数据(详细见“结果”)；n小鼠的数量
实施例12在猪上进行的初步研究采用大约30kg重的丹麦猪。这些动物在SC注射1ml蒽环类药期间被完全麻醉并进行人为的通气。在一个实验(n＝2)中，在未接受ICRF-187的猪中SC施用3mg多柔比星后出现损伤，而在t＝0时经IV施用25mg/kgICRF-187处理的猪没有出现溃疡。在第二个实验(n＝3)中，在连续三天每天用25mg/kg ICRF-187 IV处理的猪中，SC施用1ml柔红霉素后没有出现损伤，而在t＝0用50mg/kg IV处理的猪中出现小的损伤，在未处理的猪中出现大的损伤。
总之，在猪上进行的这些实验证实了我们小鼠实验的结果，即ICRF-187以时间表依赖性方式防止了SC蒽环类药诱导的损伤。
在外渗后2小时30分钟开始第1天用1000mg/m2、第2天用1000mg/m2、而第三天用500mg/m2剂量的ICRF-187进行ICRF-187治疗。之后数周内该患者未出现来自该治疗的副作用。由临床肿瘤学家和整形外科医生以及采用超声所作的每周评价显示在皮下有一大约3×4cm的块，该块的大小在该事件后的30天评价期中没有改变。没有溃疡或皮肤坏死迹象出现，尽管多柔比星的剂量很大。在延迟仅一周后未经手术干预该患者继续进行化疗。
参考文献列表1.Froelich-Ammon SJ，Osheroff N。拓扑异构酶毒药利用酶机制的阴暗面。J.Biol.Chem.1995；27021429-32。2.Chen AY，Liu LF。DNA拓扑异构酶必需酶和致死标靶。Annu Rev PharmaToxicol 1994；34191-218。3.Jensen PB，S?rensen，BS，Sehested M，Grue P，Demant EJF，HansenHH。在酸性环境中将针对拓扑异构酶II的表鬼臼毒素的毒性导向肿瘤细胞。癌症研究(Cance Res.)1994；542959-63。4.Sehested M，Jensen PB。采用DNA拓扑异构酶II毒药(依托泊苷、杀郭虫菌素)和催化抑制剂(阿柔比星，ICRF-187)对拓扑异构酶II催化周期的4个不同步骤作图。Biochem.Pharmacol.1996；51879-86。5.1/2S?rensen BS，Sinding J，Andersen AH，Alsner J，Jensen PB，Westergaard O。拓扑异构酶II靶向试剂在特定DNA序列处的作用模型DNA结合的解偶联、切割和再连接事件。分子生物学杂志(J MolBiol)1992；228778-86。6.Tanabe K，Ikegami Y，Ishida R，Andoh T。抗肿瘤药剂双(2，6-二氧哌嗪)衍生物对拓扑异构酶II的抑制。癌症研究(Cancer Res)1991；514093-8。7.Berger JM，Gamblin SJ，Harrison SC，Wang JC。DNA拓扑异构酶II的结构和机制。自然(Nature)1996；379225-32。8.Roca J，Ishida R，Berger JM，Andoh T，Wang JC。抗肿瘤双二氧哌嗪通过将酵母DNA拓扑异构酶II诱捕在闭合蛋白质夹子形式抑制该酶。美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)1994；911781-5。9.Roca J，Berger JM，Harrison SC，Wang JC。II型拓扑异构酶进行的DNA运输双门控机制的直接证据。美国国家科学院院刊1996；934057-62。10.Von Hoff DD，Layard MV，Basa P等。多柔比星诱导的充血性心力衰竭的危险因素。Ann.Intern.Med.1979；91710-7。11.Von Hoff DD，Layard。柔红霉素心脏毒性发生的危险因素。CancerTreat.Rep.1981；65《suppl 4》19-23。12.Hasinoff BB。阿霉素的铁(III)和铜(II)复合物促进了心脏保护剂ICRF-187((+)-1，2-双(3，5-二氧双哌嗪基-1-基)丙烷)的水解。药剂和作用(Agents and Actions)1990；29374-81。13.Sehested M，Wessel I，Jensen LH，Holm B，Olivieri RS，KenwrickS，Creighton AM，Nitiss JL，Jensen PB。抗拓扑异构酶II催化抑制剂ICRF-159的中国仓鼠卵巢细胞；Tyr49Phe突变赋予了对双二氧哌嗪的高水平抗性。癌症研究1998；581460-8。14.Wessel I，Jensen LH，Jensen PB，Falck J，Roeth M，Nitiss JL，Sehested M。选择的抗双二氧哌嗪拓扑异构酶II(拓扑异构酶II)催化抑制剂ICRF-187的人小细胞肺癌NYH细胞(NYH/187)在该同种型的Walker A共有ATP结合位点中表现出一个功能性Arg162Gln突变。[摘要]，Proc.AACR 1998；39375。15.S?rensen M，Sehested M，Jensen PB。喜树碱诱导的细胞毒性的pH依赖性调节和由抗疟剂氯喹形成的可切割复合物。Biochem.Pharmacol.1997；54373-80。16.Ishida R，Mki T，Narita T，Yui R，Sato M，Utsumi KR，TanabeK，Andoh T。抗肿瘤双(2，6-二氧哌嗪)衍生物对细胞内拓扑异构酶II的抑制与可切割复合物形成型抑制剂不同的细胞生长抑制模式。癌症研究1991；514909-16。17.Roca J，Wang JC。由II型DNA拓扑异构酶进行的DNA运输支持双门控机制的证据。细胞(Cell)1994；77609-16。18.Sehested M，Jensen PB，S?rensen BS，Holm B，Friche E，DemantEJF。心脏保护剂(+)-1，2-双(3，5-二氧哌嗪-1-基)丙烷(ICRF-187)对DNA断裂的拮抗作用以及针对拓扑异构酶II的药物柔红霉素和依托泊苷(VP-16)诱导的细胞毒性。Biochem.Pharmacol.1993；46389-93。19.Loth TS，Eversmann WW，Jr。用于化疗剂外渗的治疗方法比较研究。J.Hand Surg.Am.1986；11(3)388-96。20.Sonneveld P.Wassenaar HA，Nooter K。多柔比星外渗后在人皮肤中的长期滞留。Cancer Treat.Rep.1984；68(6)895-6。21.Banerjee A。癌症化疗剂诱导的静脉周外渗损伤。Postgrad.Med.1987；635-9。22.Dorr RT，Alberts DS，Stone A。在小鼠中多柔比星皮肤毒性的冷保护和热加强。Cancer Treat Rep.1985；69(4)431-7。23.Dorr RT，Alberts DS，Chen HS。皮质类固醇在小鼠中缓解实验性多柔比星皮肤毒性的有限作用。Cancer Chemother.Pharmacol.1980；517。24.Bartowski DL，Daniels JR。碳酸氢钠在大鼠中作为缓解多柔比星诱导皮肤坏死的方法的应用。Cancer Chemother.Pharmacol.1981；4179。25.Disa JJ，Chang RR，Mucci SJ，Goldberg NH。采用透明质酸酶浸润防止阿霉素诱导的完全厚度的皮肤丧失。Plast.Reconstr.Surg.1998；101(2)370-4。26.Dorr RT，Alberts DS。β-肾上腺素能化合物对实验性多柔比星皮肤毒性的调节。癌症研究1981；41(6)2428-32。27.Dorr RT，Alberts DS。在小鼠中DMSO和维生素E不能防止多柔比星造成的皮肤溃疡。Cancer Treat.Rep.1983；67(5)499-501。28.Soble M，Dorr RT，Plezia P，Breckenridge S。在用DNA结合抗肿瘤抗生素处理的小鼠中剂量依赖性的皮肤溃疡。Cancer Chemother.Pharmacol.1987；2033-6。29.Bekerecioglu M，Kutluhan A，Demirtas I，Karaayvaz M.用各种自由基清除剂防止阿霉素诱导的皮肤坏死。J.Surg.Res.1998；75(1)61-5。30.Averbuch SD，Gandiano G，Koch TH，Bachur NR。在猪模型中多柔比星诱导的皮肤坏死用一种新的基团二聚体进行的保护。J.Clin.Oncol.1986；4(1)88-94。31.Dahlstrom KK，Chenoufi HL，Daugaard S。多柔比星外渗的荧光显微镜显示和划分。实验和临床研究。癌症(Cancer)1990；65(8)1722-6。32.Rudolph R，Suzuki M，Luce JK。阿霉素造成的实验性皮肤坏死。Cancer Treat.Rep.1979；63(4)529-37。33.Bleicher JN，Haynes W，Massop DW，Daneff RM。采用荧光显微镜描述阿霉素的外渗。Plast.Reconstr.Surg.1984；74(1)114-6。34.Luedke DW，Kennedy PS，Rietschel RL。阿霉素诱导的皮肤和皮下损伤的组织病理机制。Plast.Reconstr.Surg.1979；65(4)463-5。35.Brothers TE，Von Moll LK，Niederhuber JE，Roberts JA，Walker-Andrews S，Ensminger WD。300名患者中皮下灌输通道的经验。Surg Gynecol Obstet 1988；166295。36.欧洲共同体议会(European Communities Council)B 86 A.D.；86/609/EEC。37.欧洲议会条约(The Council of Europe Convention)S 1986；38.Svendsen P，Svendsen P和Hau J编。实验室动物科学手册(Handbookof Laboratoty Animal Science)。第1版，CRC Press公司；1994，第332页。


本发明涉及用于药物治疗拓扑异构酶II毒药例如蒽环类药意外外渗的方法和药物。具体地,本发明涉及拓扑异构酶II催化抑制剂例如双二氧哌嗪ICRF－187在制备用于治疗拓扑异构酶II毒药意外外渗的药物中的用途,以及用于治疗拓扑异构酶毒药例如蒽环类药柔红霉素、多柔比星、表柔比星或伊达比星这种外渗的方法。此外,本发明还涉及用于此类治疗的药盒。