专利名称：一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿 ...的制作方法石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳香烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物，是人类最主要的能源之一。但是，随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，其中原油开采和冶炼过程中的工业污水排放和溢油泄漏事故是导致土壤石油烃污染的主要原因，不仅破坏了生态环境，还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。特别是多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期较长，并且大多具有致畸、 致癌和致突变效应，因此成为人类健康的巨大威胁。我国石油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不同程度的石油烃污染。因此，对石油烃污染土壤进行修复、恢复其生态功能以保障农产品安全是一项十分迫切的任务。环境中的微生物由于其高度的遗传多样性和功能多样性，在污染物降解过程中发挥着重要作用，从实验室分离高效功能微生物并投加到环境中加速污染物的代谢是目前主要采用的微生物修复方式。但由于接种的高效降解菌与土著微生物在营养和空间上的竞争及环境中的各种不利条件，往往导致接种的功能微生物很难存活，不能持久发挥生物修复作用。这一问题成为制约生物修复技术高效、持久发挥作用的“瓶颈”。为解决上述“瓶颈”问题，一些学者提出接种携带特定降解基因的广宿主可自我转移质粒(Self-transmissible broad host range plasmids)，接种后，随着广宿主代谢质粒在环境中的水平基因转移，代谢基因转移至土著细菌并在其中表达，可使具有竞争性的土著微生物获得降解能力，从而不必考虑供体菌的存活条件。这种由广宿主质粒水平基因转移介导的生物修复提出了与传统生物修复技术完全不同的思路和概念，有望成为一种新的污染物生物修复途径。所谓的“广宿主质粒”被定义为至少能够在变性细菌(Proteobacteria)两个亚纲 (例如β_，Y")之间互相转移并稳定传代的质粒。广宿主质粒的结构一般由两个区域组成，一个是质粒骨架(与质粒的复制、稳定性和可转移性有关)，一个是装配基因(能够赋予宿主特定的表型，例如抗药性、金属抗性、降解污染物特性等)。这两个区域一般形成“嵌合”结构(如附图ι所示)，并都具有遗传多样性。目前仅有少数广宿主质粒进行了全序列分析或者遗传特性鉴定，在2004年以前进行全序列分析的广宿主质粒仅有7个。并且研究比较透彻的可自我转移广宿主质粒，大都是从可培养的宿主中分离的，提取质粒后进行广宿主性和遗传多样性分析，即所谓的“内源分离法”。但这种方法存在着很大的局限性，首先，大部分细菌是不可培养的，因此这种传统的从可培养宿主中分离质粒的方法大大降低了发现新的广宿主质粒的几率；其次，这种方法不涉及质粒的转移过程，因此在分离过程中不能确定所分离质粒的自我转移特性。为了避免这一问题，发展了“外源质粒分离”方法，其中在国外应用较早的是“双亲配对法”。双亲外源质粒分离法的基本原理是，环境样品本源微生物群落作为广宿主质粒供体，通过与合适受体菌之间的接合转移，然后通过质粒所编码的特定表型特征(例如重金属抗性或者降解污染物的能力)筛选接合子，从而从环境样品中获得广宿主质粒。但这种方法的局限性在于所分离的质粒必须具有特定的表型特征，才能作为筛选接合子的标记。
本发明目的在于提供一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，选用不同的ftOtecAacteria亚纲的染色体带有选择标记的受体菌与携带不能自我转移(Tra-Mob+)并带选择标记质粒的供体菌，通过与样品三亲配对接合，供体菌的质粒在样品中的可自转(Tra+Mob+)广宿主质粒的协助下进入受体菌，，接合子通过受体菌和供体菌带有的筛选标记进行筛选，再将筛选的含有可自转广宿主质粒的接合子在以石油烃为唯一碳源的培养基中培养，筛选能够降解石油烃的广宿主质粒。所述筛选方法具体为1)制备微生物细胞悬液取待测样品加入生理盐水中在摇床上震荡，而后将悬浮液静置，取上清液进行离心；沉淀置于LB液体培养基中重悬，充分涡流，待用；2)供体菌和受体菌的活化和液体培养分别将冻存的携带不能自我转移 (Tra-Mob+)，并带选择标记质粒的供体菌和染色体带有选择标记的受体菌在含有相应选择标记的LB固体培养基30°C下过夜培养；而后上述供体菌、受体菌单菌落分别接种于不含有选择标记的LB液体培养基中，30°C摇床过夜培养，待用；3)三亲配对用稀释10倍的LB培养液将步骤2、中生长充分的供体菌和受体菌培养液分别稀释至10_2倍；分别取上述稀释后供体菌和受体菌与微生物细胞悬液混合，而后离心并用1/10LB液体培养基重悬上述沉淀，重悬后培养液滴至LB固体培养基中30°C下过夜培养，待用；4)接合子筛选刮取步骤幻中生长的菌苔，于无菌生理盐水中重悬培养物，用无菌生理盐水在无菌条件下稀释至10_4，取0. Iml稀释度为IOtl-KT1的上述重悬培养物涂布含受体菌的选择标记和供体菌质粒的选择标记的双选择标记的LB固体培养基中，置于30°C 恒温培养箱中，过夜培养；5)质粒小量制备和多样性验证挑取步骤4)中接合子单菌落，接入上述含双选择标记的LB液体培养基中，30°C摇床过夜培养；而后采用SDS-碱解法提取接合子的质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳，筛选广宿主质粒；获得质粒DNA后，选取常用限制性内切酶对所分离的质粒进行酶切分析，一般认为经两种以上内切酶切割后，不同的电泳指纹图谱代表不同的质粒。6)质粒石油烃代谢功能验证将上述所得接合子接种于以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基中培养，具有石油烃降解能力的接合子在液体培养基中会表现出生长，待培养液中培养基变浑浊，0D600明显变化，即为该接合子含有以石油烃为唯一碳源的广宿主石油烃代谢质粒；或将上述所得接合子点种在以多环芳烃组分为唯一碳源的固体双层平板上30°C 培养，具有石油烃降解能力的接合子在液体培养基中会表现出生长，并将固体平板在紫外光下，菌落周围培养基在紫外光下的吸收减弱，菌落周围出现降解暗圈，即该接合子含有以多环芳烃为唯一碳源的广宿主石油烃代谢质粒。所述LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4 ；LB固体培养基配方为在LB液体培养基中加入2%重量的琼脂粉。以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基取5g/L石油烃组分母液(丙酮或水配制)，0. 22 μ m滤膜除菌，量取50-200 μ 1母液，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使底物的终浓度为50-200mg L—1。所述以多环芳烃组分为唯一碳源的固体双层平板为无菌的平皿中先倾入20ml 下层培养基，下层培养基为固体无机盐培养基；待下层培养基凝固后，再加入IOml上层培养基，上层培养基为含有多环芳烃的固体无机盐培养基即以多环芳烃为唯一碳源的固体无机盐培养基。液体无机盐培养基配方为=K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgSO4 0.2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸馏水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方为 FeSO2 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g, ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸馏水定容至 1000ml ；固体无机盐培养基配方为液体无机盐培养基中加入2%重量的琼脂粉。所述供体菌为E. coli JM109 (pBBRlMCS)(质粒编码氯霉素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farri s, R.Mart in Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166(1995)175-176.，E.coli JMlO9 (pBBRlMCS-5)(质粒编码庆大霉素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R. Martin Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene, 166 (1995) 175-176.或 Ε. coli DH5 (pSU4814)(质粒编码氯霉素抗性)[Belen Mftez and Fernando de la Cruz. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF13 relaxation. Molecular Microbiology (2001) 39 (4)，1088-1099;受体菌为 Ε· coli K12rif (利福平抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990, 2471-2479.、E. coli K12nal (萘啶酸抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology,1990，2471-2479.、、P. putida UW3 (利福平抗性)Winnie Dejonghe, Johan Goris, Said el Fantroussi, Menica Hof te, Paul de Vos, Willy Verstraete, and Eva M. Top. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4~D)Degradation Plasmids on 2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney. Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology,1995，1691-1698。上述供体菌或受体菌可参见文献中记载其所带质粒。本发明中，所选取的代表性的石油烃底物包括正构烷烃(正辛烷)、单环芳烃(苯、 甲苯)、多环芳烃(萘、芴、菲)及其主要代谢中间产物(水杨酸、邻苯二酚)为底物。多环芳烃的降解能力可通过固体双层平板法验证，其他底物可采用液体摇瓶法验证。三亲配对接合法原理为一个携带质粒的供体菌，该质粒可被移动但不能自我转移(Tra-Mob+)，并带有一定选择标记；一个染色体带有选择标记的受体菌，该受体菌与供体菌在遗传分类上最好是属于不同的I^rotecAacteria亚纲，这样就能增加分离广宿主质粒的几率；第三个元素就是含有广宿主可自我转移质粒(Tra+Mob+)的土壤样品。当三方进行接合配对时，供体菌的质粒(Tra-Mob+)在土壤本源微生物群落所含有的广宿主质粒的协助下转移进入受体菌，通过特定的筛选标记，就能够得到同时获得供体菌质粒 (Tra-Mob+)和土壤样品中的广宿主质粒(Tra+Mob+)的接合子，从而大大扩展了所分离质粒的范围(如附图2所示)。本发明的有益效果如下1.本发明采用三亲配对接合法从土壤样品中直接筛选得到广宿主代谢质粒，可以直接从土壤样品中获得由广宿主质粒携带的降解基因资源，并有望开发一种由广宿主质粒水平基因转移介导的新的生物修复途径。2.本发明所采用的三亲配对接合法，参与配对的供体菌和受体菌在遗传分类上一般属于不同的ftOtecAacteria亚纲，增加了分离广宿主质粒的几率。3.与传统“内源分离法”和“双亲配对接合法”相比，本发明三亲配对接合技术不必考虑质粒原来的宿主是否可培养，也不必预先知道质粒本身所携带的表型特征(例如某种石油烃组分的降解能力)。4.实验室研究表明，采用本发明提供的“三亲配对接合法”，能够从石油污染土壤中筛选降解正辛烷、多环芳烃萘、芴和菲的广宿主代谢质粒，从而为进一步采用该质粒进行污染土壤生物修复提供了遗传材料。图1为广宿主质粒的“嵌合”结构示意图。图2为本发明实施例提供的采用三亲配对接合法从环境样品中分离自转移广宿主质粒示意图。图3为本发明实施例提供的质粒PSF2-1和质粒pSFl_3琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4为本发明实施例提供的质粒PSF2-1和质粒pSFl_3 pstl酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱。图5为本发明实施例提供的质粒pSFl-3在芴双层平板上形成的降解暗圈(紫外灯下观察)。图6为本发明实施例提供的质粒PSF2-1在菲双层平板上形成的降解暗圈(紫外灯下观察)。图7为本发明实施例提供的质粒pSF5-22、pSF5_M和pSF6_21琼脂糖凝胶电泳图谱。图8为本发明实施例提供的质粒pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21 EcoR I酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱。图9为本发明实施例提供的质粒PSF5-22和pSF5_M在萘双层平板上形成的降解暗圈(紫外灯下观察)。图10为本发明实施例提供的质粒PSF6-21在菲双层平板上形成的降解暗圈(紫外灯下观察)。

或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney.Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology, 1995，1691-1698。上述供体菌或受体菌可参见文献中记载其所带质粒。本发明中，用于质粒多样性分析的常用限制性内切酶，通常选取如EcoR I，BamH I, pst I 等。本发明中，LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂粉 20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4。LB固体培养基配方为LB液体培养基，加入2% 重量的琼脂粉。本发明中，以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基配制方法取5g/L石油烃组分母液(丙酮或水配制)，0. 22 μ m滤膜除菌，量取50-200 μ 1母液，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使底物的终浓度为50-200mg厂1。本发明中，多环芳烃固体双层平板制备方法在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基，既固体无机盐培养基；待下层培养基凝固后，再加入IOml上层培养基，既以多环芳烃为唯一碳源的固体无机盐培养基。本发明中，液体无机盐培养基配方为=K2HPO4 2g、KH2PO4 0. 5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgS04 0. 2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液1ml，用蒸馏水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方为FeS02 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g、ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸馏水定容至 1000ml。固体无机盐培养基配方为液体无机盐培养基，加入2%重量的琼脂粉。实施例1采集沈抚灌区石油污水灌溉50余年的稻田表层(0-20cm) 土壤，过Imm筛，4°C冰箱保存。称取土壤样品5g (干重)加入盛有25ml生理盐水(0. 85% NaCl溶液)的100ml 三角瓶中，在摇床上震荡1小时；悬浮液静置约30min，将上清液倒到30ml无菌离心管中， 10，OOOrpm 4°C离心IOmin ；沉淀置于:3ml 1/10LB液体培养基中重悬，充分涡旋。选取合适的供体菌和受体菌组合，保证二者带有不同的遗传选择标记，并最好来源于不同的I^rotecAacteria亚纲。将甘油管冻存的供体菌、受体菌株从-70°C冰箱中取出， 在含有相应选择标记的LB固体平板上划线，置于30°C过夜培养。用灭菌接种针将上述培养好的供体菌、受体菌菌落接种于5ml不含抗生素的LB液体培养基中，30°C摇床过夜培养。用1/10LB培养液将上述中生长充分的供体菌和受体菌过夜培养液稀释至10_2倍； 对照组分别为移取500 μ 1稀释后的供体、受体和土壤细胞悬液均装在1. 5ml管中；配对组需将上述三方各500 μ 1移至同一管中。10，OOOrpm离心2-3min。50 μ 1 1/10LB液体培养基重悬上述沉淀，滴至LB固体平板上，30°C过夜培养。(土壤和配对悬浮液会含有土壤颗粒，50 μ 1可能很难重悬，尽可能的将所有的悬浮液转移至LB平板上)。可供选择的供体菌为Ε. coli JM109 (pBBRlMCS)(质粒编码氯霉素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farri s, R.Mart in Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166(1995)175-176.，E.coli JMlO9 (pBBRlMCS-5)(质粒编码庆大霉素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R. Martin Roop II andKenneth Μ.Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166 (1995) 175-176.或 Ε. coli DH5 (pSU4814)(质粒编码氯霉素抗性)[Belen Mftez and Fernando de la Cruz. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF13 relaxation. Molecular Microbiology (2001) 39 (4)，1088-1099;受体菌为 Ε· coli K12rif (利福平抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990, 2471-2479.、E. coli K12nal (萘啶酸抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990,2471-2479.、P.putida UW3(利福平抗性)[Winnie Dejonghe, Johan Goris, Said el Fantroussi, Monica Hof te, Paul de Vos, Willy Verstraete, and Eva M. Top. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4~D)Degradation Plasmids on 2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304
或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney. Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology,1995，1691-1698。LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4。LB固体培养基配方为LB液体培养基，加入2%重量的琼脂粉。实施例2刮取实施例1中在LB平板上生长的对照组和配对组菌苔，于2ml无菌生理盐水中重悬培养物，用无菌生理盐水在无菌条件下稀释至10_4，取0. Iml稀释度为10_3-10_4的对照组涂布含相应抗生素选择标记的LB固体平板，取0. Iml稀释度为IOtl-KT1的配对组涂布含相应双抗生素(受体菌的抗生素抗性和供体菌质粒的抗生素抗性)标记的LB固体平板，置于30°C恒温培养箱中，过夜培养。挑取接合子单菌落，接入5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，30°C摇床过夜培养。采用SDS-碱解法提取各接合子的质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳图谱上除显示供体菌的较小质粒(Tra-Mob+)分子量，还显示一较大分质量的质粒，即为该接合子含有从样品内转入的广宿主质粒。获得质粒DNA后，选取常用限制性内切酶，如EcoR I, BamH I，pst I 等，对所分离的质粒进行酶切分析，一般认为经两种以上内切酶切割后，不同的电泳指纹图谱代表不同的质粒。实施例3选取实施例2中含不同质粒的接合子菌株，接种于LB液体培养基，培养至OD6tltl = 0. 6-0. 8，按质量百分比10%接种量接入以某石油烃组分(正辛烷、苯、甲苯)及其主要代谢中间产物(水杨酸、邻苯二酚)为底物为唯一碳源的液体无机盐培养基中，置于30°C恒温摇床上ISOrpm培养5_10天(培养时间根据不同石油烃组分而定)。观测含接合子的菌株是否能以这些石油烃组分生长(测定菌体密度0D600值)。以石油烃为唯一碳源的液体无机盐培养基配制方法取5g/L石油烃组分母液(丙酮或水配制)，0. 22 μ m滤膜除菌，量取 50-200 μ 1母液，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使底物的终浓度为50_200mg L—1。对于多环芳烃(萘、芴、菲)降解能力的验证，将实施例2中含不同质粒的接合子菌株，用灭菌牙签点种于以某多环芳烃组分唯一碳源的固体双层平板上，培养一段时间，具有降解能力的接合子(所携带的质粒上有降解基因)会在固体平板上菌落周围会出现降解暗圈(肉眼可辨，但在紫外灯下更加清晰)。多环芳烃固体双层平板制备方法在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基，既固体无机盐培养基；待下层培养基凝固后，再加入IOml上层培养基，既以多环芳烃为唯一碳源的固体无机盐培养基。液体无机盐培养基配方为=K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgSO4 0.2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸馏水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方为 FeSO2 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g, ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸馏水定容至 1000ml。固体无机盐培养基配方为液体无机盐培养基，加入2%重量的琼脂粉。应用例1采集沈抚灌区石油污水灌溉50余年的稻田表层(0-20cm) 土壤作为供试土壤，采用本发明提供的“三亲配对接合法”，选取的供体菌/受体菌组合为E. coli DH5(pSU4814) (质粒编码氯霉素抗性)/P. putida UW3(利福平抗性)。通过与土壤悬液进行三亲配对，采用含氯霉素和利福平LB选择平板筛选接合子，获得了 2个含广宿主大质粒的接合子，将这两个质粒分别命名为PSF1-3和pSF2-l。质粒的电泳图谱如附图3所示。采用限制性内切酶pst I对质粒进行消化，酶切图谱如附图4所示，表明这两个质粒为两个不同的质粒。采用液体摇瓶法检测质粒pSFl-3和pSF2-l对正辛烷、苯、甲苯、水杨酸和邻苯二酚的降解能力，结果表明，质粒PSF1-3能够利用正辛烷、苯、甲苯、水杨酸和邻苯二酚作为唯一碳源生长；在芴双层平板上出现了降解暗圈(参见图5)，但不能降解萘和菲。质粒 PSF2-1只能利用苯、水杨酸和邻苯二酚作为唯一碳源生长；但在菲双层平板上可见降解暗圈(参见图6)。应用例2采集沈抚灌区石油污水灌溉50余年的稻田表层(0-20cm) 土壤作为供试土壤，采用本发明提供的“三亲配对接合法”，选取的供体菌/受体菌组合为E. coli JM109(pBBRlMCS4)(质粒编码庆大霉素抗性VC.necator JMP228 (利福平抗性)。通过与土壤悬液进行三亲配对，采用含庆大霉素和利福平的LB选择平板筛选接合子，获得了 3个含广宿主大质粒的接合子，将这3个质粒分别命名为pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21。质粒的电泳图谱如图7所示。采用限制性内切酶EcoR I对该质粒进行消化，酶切图谱如图8所示，表明这3个质粒为不同的质粒。采用液体摇瓶法检测质粒pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21对石油烃组分的降解能力，结果表明，质粒PSF5-22和pSF5-24能够在萘双层平板上出现降解暗圈，但不十分清晰 (参见图9)；质粒PSF6-21能够在含菲的双层平板上出现比较明显的降解暗圈(参见图10)。


本发明涉及生物学技术和污染土壤生物修复技术交叉领域，具体的说一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法。选用不同的Proteobacteria亚纲的染色体带有选择标记的受体菌与携带不能自我转移(Tra-Mob+)并带选择标记质粒的供体菌，通过与样品三亲配对接合，供体菌的质粒在样品中的可自转(Tra+Mob+)广宿主质粒的协助下进入受体菌，接合子通过受体菌和供体菌质粒带有的选择标记进行筛选。再将筛选的含有可自转广宿主质粒的接合子在以石油烃为唯一碳源的培养基中培养，筛选能够降解石油烃的广宿主质粒。采用本发明提供的三亲配对接合法”能够从石油污染土壤中直接分离降解正辛烷、多环芳烃萘、芴和菲的广宿主代谢质粒，从而为进一步采用该质粒进行污染土壤生物修复提供了遗传材料。