专利名称：一种禽蛋开窗封口方法家禽转基因对于获取特定基因类型动物模型及生产治疗价值药用蛋白具有十分重要的意义，科学与商业潜在价值巨大。由于家禽特殊的生殖、生理特点及受技术条件限制，目前最常用且又最实用的方法是针对禽蛋进行转基因操作。而针对禽蛋的操作必然涉及打开蛋壳及壳膜以接近胚胎。又可分两种情况，一是换蛋壳法，即被操作禽胚蛋较小，于钝端打开蛋壳转基因操作后全蛋液移入一个较大的新鲜钝端开口的空蛋壳中(如用鸡胚转基因操作后，移入鹅蛋壳之中孵化)。显然，这一方法操作复杂，试验材料获取较困难，而且还需要特定的仪器设备，实际操作成功率也比较低；另一种是赤道板开窗法，大致过程是先将蛋平放静置几小时，待胚胎上浮后，于平置禽蛋最高点(赤道板位置)处在蛋壳上打开一个5mm见方的小孔，从小孔处观察胚胎进行相应转基因操作，最后以特定材料封口后送孵。与换蛋壳法相比，开窗法条件要求少，操作相对简单，是比较主流的家禽转基因操作方法。试验表明，禽蛋蛋壳打开后会导致胚胎孵化率的大幅下降，如，Xu et al. (2009) 采用开窗法以慢病毒注射获得了 15%的孵化率，类似方法Chapman et al. (2005)为4%， Harvey et al. (2002)及Mozdziak et al. (2003)采用致癌病毒制作转基因鸡的孵化率为 23%和36%，McGrew et al. (2004)采用换蛋壳方法孵化率为27%。如此低的孵化率，再考虑到较低的转基因效率，实际每一次操作能得到的转基因个体数十分有限，这成为限制家禽转基因生产的一个重要制约因素，因此，研究探讨如何提高转基因禽蛋孵化率就显的十分必要，成为很多研究、生产者首要解决的问题。就禽蛋开窗后孵化率大幅降低的原因Ivarie团队进行了深入的研究其成员 Andacht et al. (2004)的试验结果表明，开窗后少量空气(气泡)进入禽蛋内部既会导致孵化率的大幅下降(下降65%)，同时即使没有空气进入，开口长时间暴露于空气也会导致孵化率降低。由此，他们提出提高开窗后禽蛋孵化率的关键就是避免操作过程中空气的进入，并以此为出发点进行创新探索申报了两项专利。专利一，禽蛋操作方法(METHODFOR MANIPULATING AVIAN EGGS, 1999, Patent Number 5, 897，998)。与常规操作方法相比，其创新之处在于，开窗时先打开蛋壳，但保留完整蛋壳膜，滴加液滴完全覆盖开口后，再去除蛋壳膜，过程中保持液滴形态以隔离空气进入蛋内，然后透过液滴进行相关胚胎操作并最后封口。经过这一小小的改进，孵化率从常规操作方法的8. 2%提高到32% (Speksnijder & Ivarie, 2000)。但这种方法也存在一些明显的问题如，滴加液体覆盖开口时，滴液量不容易控制，滴多了易流淌造成封隔空气失败，滴少失去封阻空气进入的效果(而大多蛋会吸收较多液体)，且不同蛋间外形差异大，难有统一标准；而且，有些蛋壳表面常常有亲水性，根本无法形成液滴达到封隔的目的，因此有人尝试通过在封口周边涂抹疏水物质如石蜡油等，虽有一定效果，但仍然不方便操作，尤其是涂抹疏水物质后常常影响最后封口的效果，导致封口不牢容易脱落而致孵化失败。发明者也承认通过这种方法改进，虽然孵化率有明显提高但仍有约40%禽蛋中进入了气泡，因此，在气密性方面进一步改进方案仍有提高孵化效果的空间。专利二，蛋开窗方法(METHODFOR WINDOWING EGGS, 2002, Patent No.US6, 397, 777 BI)针对专利一实施过程仍有气泡进入的问题，Ivarie团队在专利一思路基础之上做如下调整，首先是用低熔点热熔胶代替液滴封阻空气进入，其次采用在蛋壳上开两孔方式有效排除空气。具体过程是，除同专利一在禽蛋赤道板位置开一窗口外，在禽蛋钝端顶部再开一窗口，但前者去除壳膜，而钝端开口保留完整壳膜，然后赤道板位置窗口以热熔胶完全覆盖，在熔胶未凝固前通过在钝端窗口处隔蛋壳膜吹气增压使蛋内气泡通过赤道板窗口排出，胚胎操作也必须在热熔胶凝固之前进行。改进后操作方法可将孵化率提高至45. 3%。但这种方法的弊端也显而易见，最突出的问题是，由于低熔点热熔胶的凝固 点一般在60-80°C度，低于此温度会很快凝固，在正常室温操作环境下留给胚胎定位并操作及排出气体的时间十分有限(而这往往是很费时的)，常导致手忙脚乱，操作成功率很低。(操作成功率指能完成全部试验操作步骤的合格个体数，操作成功个体才进入孵化并计算孵化率。)
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种禽蛋开窗封口方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现—种禽蛋开窗封口方法,于禽蛋赤道板位置开直径为O. 3cm O. 6cm窗口，保留完整蛋壳膜，以窗口中心为圆心以固体形式在蛋壳上围成一个内径为O. 8cm I. 2cm的同心封闭圈，待同心封闭圈与蛋壳表面粘合牢固后滴加生理缓冲液，在缓冲液封阻条件下去除蛋壳膜，定位胚胎并进行胚胎操作，然后用事先准备好的直径为O. 6cm I. Ocm的蛋壳膜在液面下完全覆盖窗口，以吸水纸吸取封闭圈中的多余液体，再以热熔胶充填封闭圈内部进行封口。所述的开窗方法中，优选以窗口中心为圆心以热熔胶、明胶或用橡胶圈粘上粘胶在蛋壳上围成一个内径为O. 8cm I. 2cm的固体同心封闭圈。所述的热熔胶优选低软化点热熔胶，进一步优选EVA热熔胶。所述的生理缓冲液为加入抗生素的生理缓冲液，优选加入1%0 (w/v)氨苄青霉素及链霉素的生理缓冲液，进一步优选加入1%。(lmg/1000ml)氨苄青霉素及链霉素的pH7.2,0. 02M的PBS缓冲液、Hanks缓冲液、M199培养基或DMEM培养基中的任一种。所述的缓冲液中优选加入抗氧化剂。所述的抗氧剂选自Vc、VE、槲皮素、茶多酚、没食子酸丙酯、愈创树脂、N—乙酰半胱氨酸、白藜芦醇、a-硫辛酸或芦丁，优选Vc、VE、槲皮素。Vc在所述的缓冲液中的终浓度优选为2-20 μ g/ml ；VE在所述的生理缓冲液中的终浓度优选为5-25 μ Μ，槲皮素在所述的生理缓冲液中的终浓度优选为0. 1-0. 5 μ M0所述的禽蛋为鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋或其它禽卵。有益效果本发明在开窗前先使用热熔胶、明胶等围成固体封闭圈，再滴加生理缓冲液，在缓冲液封阻条件下去除蛋壳膜，具有如下优点1、保证有足够量的封阻空气用液体，不会流淌，可完全避免空气的进入。2、由于热熔胶、明胶等本身有疏水性，加液后可一直保持凸出状，有放大镜效果便于观察蛋内胚胎。3、由于热熔胶封闭圈是在加液及其它操作前先粘合于蛋壳之上，完全密闭，粘结牢固不会脱落。4、孵化率高，在已知慢病毒对细胞有毒性作用的前提下孵化率仍达48. 9%。5、保证充裕试验操作时间。6、操作简单，过程易于控制。作为本发明的优选技术方案，我们对生理缓冲液的成分进行了调整、改变，增加了新成分抗氧化剂。据文献报导及试验分析，禽蛋孵化率下降与空气进入有关，同时禽蛋开窗后即使没能进入气泡，长时间曝露于空气中也可使孵化率下降，因此我们怀疑孵化率的下降可能与蛋清中氧分压增大导致氧化应激有关。我们选择常见抗氧化剂维生素C(Vc)、维生素E(VE)、槲皮素进行试验，通过对比不同浓度Vc、VE、槲皮素对开窗禽蛋孵化率的影响， 发现低浓度VC可使孵化率提高约10个百分点，VE、槲皮素提高约3-5个百分点。 图I不同处理组孵化率比较。图2转基因PCR验证图。其中，I 8泳道分别表示检测样品，M为分子量标记。

FPLV20.5 μ I
RPLV20.5μΙ
Taq 酶0.125μΙ反应体系(25μI) dNTP2μΙ
IOxbuffer2.5μΙ
H2O19.375μΙ
基因组DNA IOOngPCR产物的电泳图见图2，I 8泳道分别表示检测样品，M为分子量标记。检测结果进行统计在有效提取样品中，转基因检出效率为47%。实施例2受精鸡蛋取自温氏集团太仓种鸡场。新鲜受精蛋经75%酒精表面灭菌后平置于蛋盘上，用普通墨水标记最高点后，室温过夜使胚盘上浮固定。第二天，用迷你电钻(台湾宝工，型号1ΡΚ-500Β-2)于鸡蛋侧面标记处打磨约O. 3-0. 6cm见方的窗口，同时注意保持蛋壳膜的完整。用软毛笔先清扫表面壳粉，再用75%酒精棉球擦拭干净，待干后，以明胶在蛋壳上围成一个以窗口中心为圆心，内径约Icm的同心封闭圈。待凝固后,在明胶圈内滴入含双抗(1%。w/v氨苄青霉素及1%。w/v链霉素，下同)^ 2 μ g/ml的PBS (ρΗ7· 2，O. 02M)至满，以11号手术刀小心沿窗口内缘切开蛋壳膜，再用尖嘴镊子将蛋壳膜取出，寻找胚盘按照实施例I中I. 2 I. 3记载的方法进行病毒注射、封口与孵化。结果显示孵化率达43. 1%。按照I. 6中记载的转基因检测方法进行检测，在有效提取样品中，转基因检出效率为45%。实施例3
方法同将实施例2，仅将明胶替换为热熔胶，Vc浓度改为20ii g/ml，孵化率达 45. 2%，在有效提取样品中，转基因检出效率为48%。实施例4 方法同将实施例2，仅将明胶替换为热熔胶，Vc替换为25iiM VE，孵化率达 43. 2%，在有效提取样品中，转基因检出效率为45%。实施例5方法同将实施例4，仅将VE浓度改为5 U M，缓冲液替换为Hanks缓冲液，孵化率达 42. 3%，在有效提取样品中，转基因检出效率为43%。实施例6方法同将实施例2，仅将Vc替换为0. 5 ii M槲皮素，孵化率达44. 6 %，在有效提取样品中，转基因检出效率为44%。实施例7方法同将实施例5，蛋壳上的同心圆以橡胶圈粘上粘胶围成，并将槲皮素浓度改为
0.I PM槲皮素，孵化率达42.6%，在有效提取样品中，转基因检出效率为42%。参考文献Andacht T, Hu ff, lvarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage X chicken embryo. Mol Reprod Dev.69 (2004) :31-34.Chapman SC,et al. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector. Development 132 (2004),935-940Harvey AJ, et al. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens. Nat. Biotechnol. 20(2002) :396-399.McGrew MJ, et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO 5 (2004)728-733.Mozdziak PE, et al. Development of transgenic chickens expressing bacterial b-galactosidase. Dev. Dynam. 226(2003) :439-445.Speksnijder G, lvarie R. . A modified method of shell windowing for producing somatic or germline chimeras in fertilized chicken eggs. Poult Sci. 79(2000) :1430-3.Xu SY, et al.Efficient production of transgenic chickens using self-inactive HIV-based lentiviral vectors. Current Zoology 55(2009) 383-387.


本发明属于转基因技术领域，公开了一种禽蛋开窗封口方法。本发明通过优化操作方案，有效阻隔外来空气进入开窗蛋壳内部，有效提高转基因禽蛋孵化率及转基因效率。优点包括1、保证有足够量的封阻空气用液体，不会流淌，可完全避免空气的进入。2、由于热熔胶本身有疏水性，加液后可一直保持凸出状，有放大镜效果便于观察蛋内胚胎。3、由于热熔胶封闭圈是在加液及其它操作前先粘合于蛋壳之上，完全密闭，粘结牢固不会脱落。4、孵化率高，在已知慢病毒对细胞有毒性作用的前提下孵化率仍达48.9％。5、保证充裕试验操作时间。6、操作简单，过程易于控制。