专利名称：一种可维持细胞活性的组织冻存液的制作方法低温冷冻保存是活体组织长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用，冻伤是低温保护最大的负反应，其原因可能为冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前组织的冻存主要有两种方法快速冻存法，即玻璃化法；慢速冻存法，即程序降温法。慢速冻存法较为常用。但是如果没有采取合适的冻存方法和合适的冷冻保护齐U，组织在冻存过程中容易被冻伤·超低温冷冻保存是在液氮(_196°C )中使保存的活细胞物质代谢和生长几乎完全停止的保存方法。在这样冷冻的条件下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，使细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变，细胞和组织不会丧失形态发生的潜能。但是，单纯的超低温保存会对细胞造成两方面的损伤。其一，在低温保存的过程中，细胞外部的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤；其二，随着温度的降低，细胞内的水分也会结冰，所形成的冰晶进一步破坏细胞膜和细胞器，这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。影响损伤程度的因素主要有冷冻速度、融冻速度及冷冻保护剂。冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般可分为渗透性与非渗透性两类。一般非渗透性保护剂是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤。常用的有蔗糖、聚乙烯卩比咯烧酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及轻乙基淀粉(hydroxyephylstarch, HES)等。而渗透性保护剂则主要为小分子物质,多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。主要有以下几种甘油、二甲基亚讽(DMSO)、丙_■醇、乙_■醇等。在前两种因素冷冻速度和融冻速度受目前工艺条件的限制，无法在短期内有较大改进的前提下，冷冻保护剂的正确选择及应用就成为了决定冻存效果的最关键因素。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。采用合适的方法冻存脂肪组织，并从中取得干细胞，可以为临床应用提供良好的条件，因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存液。
本发明的目的是提供一种有效的可用于脂肪组织的冻存液及脂肪组织的冻存方法。在本发明的第一方面，提供一种冻存液，包含以下组分海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为0.05 2mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为I: f 10。在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为O. Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为I:广5。·本发明的冻存液可以由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5 20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1-4 :13-18。在另一优选例中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5^10mol/l，较佳地为05 8mol/l。在另一优选例中，所述二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1-4 :13_18 ;较佳地，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-1. 5 1-1. 5 :9-11。本发明的第二方面，提供第一方面所述的冻存液的用途，被用于长期保存脂肪组织和/或建立脂肪组织库。本发明的第三方面，提供一种脂肪组织混合物，所述混合物包括以下组分脂肪组织，和第一方面所述的冻存液。在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:0. 5-5，较佳地，为I: O. 8_2 ο在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:1-1. 5。本发明的第四方面，提供一种脂肪组织库，含有第三方面所述的脂肪组织混合物。本发明的第五方面，提供第四方面所述的脂肪组织库的用途，它被用于长期保存脂肪组织。本发明的第六方面，提供一种脂肪组织的冻存方法，包括步骤(i)对获得的含脂肪干细胞的脂肪组织材料进行洗涤，从而获得去除了表面杂细胞的脂肪组织；(ii)将步骤⑴得到的脂肪组织剪碎，得到O. 8^1. 5mm3的组织块；(iii)将步骤(ii)得到的组织块与第一方面所述的冻存液进行混合，得到脂肪组织混合物；(iv)将步骤(iii)得到的脂肪组织混合物降温后，于-70°C _200°C保存。在另一优选例中，所述步骤(iii)中所述组织块与所述冻存液的体积比为1:0. 8 2。在另一优选例中，所述步骤(iv)中将脂肪组织混合物放入程序降温盒，采用程序降温法梯度降温，_80°C冰箱或液氮内保存。在另一优选例中，所述步骤(iv)使用程序降温法梯度降温，较佳地降温速率为-I至-2 °C /min。在另一优选例中，所述步骤(iv)当温度到达_25°C以下时，降温速率调至-5至-10°C /min。在另一优选例中，所述步骤(iv)中当温度达到-40°C时，将装有脂肪组织混合物的程序降温盒直接保存于_80°C冰箱中。在另一优选例中，所述步骤(iv)中当温度达到-100°C时，将装有脂肪组织混合物的程序降温盒直接保存于液氮中 。本发明提供了一种适宜冻存组织，并维持组织内细胞活性的冻存液，采用渗透剂与非渗透剂结合的方法冻存组织，能够保证从复苏的组织中培养出适用于临床的干细胞。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。图I为显微镜下观察培养第6、9、12天后、从新鲜脂肪组织中爬出的细胞的生长状态图。图2为显微镜下观察培养第6、9、12天后、从冻存复苏后的脂肪组织中爬出的细胞的生长状态图。图3为用流式细胞仪检测由复苏后的脂肪组织获得的干细胞传至第3代时表面标志抗原蛋白的鉴定结果，表明该脂肪干细胞的纯度很高。
本发明提供了一种有效的可用于脂肪组织的冻存液，包括组分海藻糖、二甲基亚讽(DMSO)和血清替代物Knockout Serum Replacement (KSR)。通常，冻存液中海藻糖的浓度为O. 05^2mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为1:广10。在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为O. Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为I:广5。在一优选配制方式中，所述冻存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5 20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1-4 13-18 ;较佳地，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5 10mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1_4 :13-18 ；更佳地，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5 8mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与 KSR 的体积比为 1-1. 5 :1-1. 5 : 9-11。在另一优选例中，所述冻存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为广3 mol/Ι，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为I :0. 8-1. 2 :7-10。在另一优选例中，所述冻存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为2mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为I :1 :8。组织冻存冻存技术是生物学保存物种的重要手段。如果在不加任何条件下直接冻存组织/细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，严重时引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，贮存在-130°C以下的低温中能减少冰晶的形成。组织/细胞冻存中最重要的部分是冻存液。本发明采用渗透剂与非渗透剂结合的方法冻存组织，能够保证从复苏的组织中培养出适用于临床的干细胞。组织冻存时可采用常规的设备和方法进行。在优选例中，可采用程序降温法，降温盒材质通常为聚碳酸脂、高密度聚乙烯和泡沫，并需要异丙醇和机械冷冻装置。冷却速率可调，并且可以重复进行，从而满足了组织冻存和复苏的需要。一种典型的降温程序为降温速率-I至_2°C /min ;当温度到达_25°C以下时，可调至_5至-10°C /min ;当温度达到_40°C时，可以放入_80°C冰箱内保存或当温度达到-100°C时，可以迅速浸入液氮中。组织在_80°C冰箱内可以保存半年或更久，在液氮中可以长期保存达数十年或更久。组织库如本发明所用，“组织库” 一词指经一定程序降温后、长期保存在特定冻存液中的组织储存。组织库中的组织可以来源于人，采用深低温储藏组织以保持其活力，供移植用。组织复苏如本发明所用，“组织复苏”一词是指休眠的组织重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将装有组织和冻存液的冷冻管迅速由液氮或-80°C冰箱转入到温水浴中，较佳地37°C _40°C，不定时搅拌加速解冻；组织完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后的组织进行清洗，接种到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养，细胞由组织中爬出并生长。细胞贴壁如本发明所用，“细胞贴壁”一词是指正常细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子，可以在该表面上生长，繁殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞。贴壁生长有接触抑制的现象，在动物细胞培养中，要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞脱落。而肿瘤细胞就没有这些特性，可以悬浮培养。干细胞抗原检测用本发明方法冻存的脂肪组织在复苏后，接种到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养，干细胞由组织中爬出并贴壁生长，消化传代，通过细胞表面抗原的检测加以验证干细胞的纯·度。脂肪干细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等。⑶34抗原是一种高度糖基化I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为彡2%，更佳地，(I. 5%。⑶45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有⑶45的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为< O. 1%。CD14是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原，带有CD14的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为< 5%，较佳地，(3% ;更佳地，(I. 5%。⑶29、⑶73、⑶49d、⑶105等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。带有⑶29的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 95%，更佳地> 98%，最佳地彡 99. 5%。带有⑶73的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为彡95%，更佳地彡98%，最佳地
彡 99%ο带有⑶90的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 95%，更佳地> 98%，最佳地
彡 99%ο带有⑶49d的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为> 95%，更佳地> 98%，最佳地
彡 99%ο本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No. 4，946，778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。自体移植组合物和施用方式本发明还提供了一种自体移植组合物，可用于抗衰老等多种用途。自体移植组合物包括有效量的、由本发明冻存液保存后并复苏的脂肪组织获得的脂肪干细胞，在一个优选例中还可以包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，对于含脂肪干细胞的组合物，优选形式为液态剂型配制好的自体移植组合物可以通过常规途径进行给药或施用，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。使用本发明的自体移植组合物时，是将安全有效量的脂肪干细胞施用于人，其中该安全有效量通常为IO5-IO8细胞/人/次，更佳地为IO6-IO7细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑施用途径、施用对象的健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明的主要优点包括
(I)冻存液成分清晰，包含渗透性保护剂和非渗透性保护剂，不含对脂肪组织有害的成分；(2)冻存液可以维持冻存的脂肪组织内细胞的活性；(3)由冻存复苏后的脂肪组织后的干细胞生长状态良好，细胞抗原特征保持稳定，纯度高；(4)从复苏的脂肪组织中培养的干细胞能够适用于临床。(5)脂肪组织直接冻存可以保存组织的原始状态，成分更接近原始组成，维持组织内生物大分子、细胞和组织微观结构的稳定性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例I脂肪组织的冻存实验材料脂肪组织从手术室取新鲜无菌脂肪组织20ml冻存液80vol%KSR+10vol%DMS0+10vol%海藻糖的KSR溶液，其中海藻糖的KSR溶液的浓度为2mol/l。实验分组A组从新鲜的脂肪组织提取细胞并培养B组从冻存后的脂肪组织提取细胞并培养实验方法(I)新鲜脂肪组织的处理无菌条件下将新鲜的脂肪组织置无菌瓶中，用DPBS或生理盐水洗涤3-4次，以去除脂肪组织表面的杂细胞等。然后用灭过菌的剪刀剪碎组织块(约Imm3大小即可)，以利于组织的冻存。将剪碎的组织平均分成两组A组和B组。(2) A组接种培养将A组脂肪组织用细胞完全培养基接种于75ml培养瓶中，置于37°C，CO2培养箱中培养。3天后给组织全量换液，记录细胞3天后、6天后、9天后、12天后的生长状况，贴壁率，并拍照记录，结果如图I所示。待细胞生长贴壁到一定密度(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的50%-60%)时，将培养瓶中组织去除，继续生长3天，并对贴壁细胞进行处理、传代。采用胰蛋白酶将贴壁的细胞进行消化，并将消化后的细胞按照1:3的比例进行接种、传代。当P3代细胞生长达到贴壁80%_90% (细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，PBS将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数。将细胞悬液离心，冻存P3代细胞。A组最终获得的P3代细胞量的结果如表I所示。(3) B 组冻存用含有特定组分的冻存液，采用程序降温法，将B组脂肪组 织冻存，O. 5ml冻存液+0.5ml脂肪(1:1)，将冻存组织放入程序降温盒里，置于_80°C冰箱内保存3个月。该程序降温盒保持_1°C /min的降温速率，次日移入液氮罐。实施例2脂肪组织的复苏和接种3个月后，取装有冻存的脂肪组织的冻存管快速置于37°C水浴中，待组织溶解后，取出组织，采用DMEM (Sigma公司)洗涤残余的冻存液。将复苏的组织接种于同A组同样大小、规格的培养瓶中，加入培养基，置于37°C，CO2培养箱中培养。组织接种，3天后将组织全量换液。镜下观察细胞的贴壁生长状况。同样每隔3天做一次记录，并拍照。结果如图2所示。3天后未发现贴壁细胞；6天后发现极少贴壁细胞，贴壁细胞呈长梭形；9天后细胞贴壁量增加，细胞生长良好；12天后较多贴壁细胞，贴壁约为65% (细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)。待细胞生长贴壁到一定密度(贴壁50%_60%)时，将培养瓶中组织去除，继续生长3天，并对贴壁细胞进行处理、传代。采用胰蛋白酶将贴壁的细胞进行消化，并将消化后的细胞按照1:3的比例进行接种、传代。当细胞的P3代细胞生长达到贴壁80%_90%时，无菌条件下消化、收集细胞，PBS将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数。B组最终获得的P3代细胞量的结果如表I所示,与A组相比,细胞量基本相同。将细胞悬液离心，冻存P3代细胞。表IA组和B组获得的P3代细胞量
W￥ |aH [bH
P3 代细胞量 2. 43 X IO8~ 2. IXlO8实施例3流式细胞仪检测取上述冻存的P3代细胞，复苏后做成细胞悬液，做流式检测，以测定所获得细胞为脂肪间充质干细胞，并进行细胞在细胞纯度上的鉴定。具体地，取细胞制作成细胞悬液，调整密度为I X IO5IiiI/1,于800r/min (120g)条件下离心5min,弃掉上清,用4°C的冷D-Hanks洗涤重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至lmL，加入抗体，用流式细胞仪检测细胞表面标记。加入的抗体分别为人抗CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD45、CD34、Actin 和 HLA-DR。结果如图 3 和表 2 所示。其中 CD29、CD73、CD49d、CD90 均为脂肪干细胞的阳性指标，CD14、CD45、CD34、Actin, HLA-DR均为阴性指标。采用同样的方法对实施例I中A组最终获得的P3代细胞进行检测，结果如表2所
/Jn ο表2流式结果


本发明提供了一种可维持细胞活性的组织冻存液。本发明的冻存液包括海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。用本发明冻存液保存的组织复苏后获得的脂肪干细胞具有贴壁生长好、纯度高、分化能力强的优点。