专利名称：β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用的制作方法地球上存在丰富的木质纤维素资源，其在可循环替代能源及基础化合物生产方面具有巨大的应用潜力。自然界存在许多可有效降解转化木质纤维素的微生物，其对木质纤维素的降解过程构成了地球碳循环的一个重要方面，如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是最重要的代表菌株。它主要通过分泌纤维素酶来降解纤维素，主要包括外切葡聚糖苷酶、 内切葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶等。真菌所产生的纤维素酶大部分都是诱导酶，通过添加诱导物及对纤维素酶合成途径进行调控是提高纤维素酶活性的有效方法。现在人们普遍认可的一个观点是从不溶性纤维素底物中释放的某些可溶性寡糖是诱导纤维素酶表达的真正诱导因子，这主要是因为某些二糖如纤维二糖(cellobiose)、δ-纤维二糖内酯 (δ-cellobiono-l，5-lactone)、乳糖(lactose)及槐糖(sophorose，由 2 个葡萄糖通过 β -1，2糖苷键连结的双糖分子)等均具有较强的纤维素酶诱导能力。纤维寡糖常用于纤维素酶水解机理和动力学的研究(Guimaraes等，J MolBiol, 320 C3)，587-96，2002)；纤维寡糖还用于研究微生物对纤维素的利用过程，包括纤维素酶合成调控、细胞生长和生物产能。另外纤维寡糖具有肠道调节作用，可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂(如纤维二糖)；纤维寡糖还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景非常广阔。纤维寡糖制备应用最广泛的方法是发烟盐酸法(Miller，G. L等，Archives of Biochemistryand Biophysics, 1960,91 (1)，1-26.)，也可以采用采用混合酸法水解结晶纤维素法(Zhang，Y. H.等，Anal Biochem，2003，322 (2)，225-32.)。但这些方法需要消耗大量的盐酸或者硫酸，成本很高，并且也给环境造成很大污染。近年来，β-葡萄糖苷酶被应用于合成生物寡糖以代替化学合成法(Saloheimo， Μ.等，ApplEnviron Microbiol. 2002,68 :4546-4553.)。目前普遍认为存在 2 种反应类型 水解反应的逆反应和转糖苷反应。在高浓度葡萄糖存在的条件下，两个葡萄糖单元能绑定到葡萄糖苷酶的活性位点上，在这两个葡萄糖之间形成一个糖苷键。至少一个葡萄糖可以绑定到酶上，在这些葡萄糖单元之间，β-1-2和β-1-4-糖苷键都能形成。但现有明确转糖基作用的葡萄糖苷酶种类少，应用条件受限较大。因此寻找新的具有转糖基作用的纤维素酶对于利用纤维素具有重要的意义。
本发明针对现有技术的不足，提供葡萄糖苷酶Cellb及其表达基因与应用。一种表达β -葡萄糖苷酶Cellb的基因eel lb，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所7J ο上述β -葡萄糖苷酶Cellb，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。本发明所涉及的基因cellb来自瑞氏木霉QM9414，在本发明的实施例1中提供了该基因cellb及β -葡萄糖苷酶Cellb的制备方法。该方法是以瑞氏木霉QM9414的总RNA 为模版，经反转录PCR方法得到cDNA，用特异性寡核苷酸引物通过PCR方法得到β -葡萄糖苷酶Cellb的cDNA。该序列由1452个核苷酸组成，编码484个氨基酸。然后通过异源表达基因cellb获得β -葡萄糖苷酶Cellb。β -葡萄糖苷酶Cellb具有转糖基活性，HPLC分析表明Cellb可以将部分葡萄糖转化为纤维二糖，将部分纤维二糖转化为纤维三糖和纤维四糖。一种重组载体，该载体包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片断。一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组载体或表达上述β -葡萄糖苷酶Cellb。上述基因cellb，β -葡萄糖苷酶Cellb、重组载体或重组细胞在合成纤维寡糖中的应用。有益效果本发明中的葡萄糖苷酶Cellb可以用于工业上合成价格昂贵的纤维寡糖，进而应用于研究纤维素酶水解机理、微生物对纤维素的利用过程等。另外这种体外生物法合成的纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂(如纤维二糖)，还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景广阔。图1纯化后的β -葡萄糖苷酶Cellb的电泳图；图2β-葡萄糖苷酶Cellb以40%葡萄糖为底物的转糖基产物分析(HPLC)，G1代表葡萄糖，G2代表纤维二糖；图3 β -葡萄糖苷酶Cellb以20%纤维二糖为底物的转糖基产物分析(HPLC)，Gl 代表葡萄糖，G2代表纤维二糖，G3代表纤维三糖，G4代表纤维四糖；图4 β -葡萄糖苷酶Cellb分别作用于不同浓度的葡萄糖和纤维二糖后的转糖基产物的产量分析。

RNA的提取采用Trizol法，Trizol试剂购自hvitrogen公司，步骤参见产品说明书。反转录采用购自Takara公司的RNA PCR Kit试剂盒，步骤参见产品说明书。(2)以步骤(1)获得的总cDNA为模板，以32a_cellb F和32a_cellb R为引物，采用PCR的方法，得到eelIb的cDNA，引物序列如下32a-cellb F:CCGGAATTCCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC ； SEQ ID NO. 332a-cellb R :CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC ； SEQ ID NO. 4反应体系(25 μ L)为
cDNA1 μL
IOx扩增缓冲液2.5 μL
dNTP (各 2.5mM)1 μ
32a-cellbF (ΙΟμΜ)1 μ
I174CupR (ΙΟμΜ)1 μ
Pfu 酶(5υ/μ )0.5 μ
ddH2018 μL
总体积将反应组分混勻后离心，置于PCR仪中反应。反应程序为94°C预变性5min ；然后进行以下循环94°C变性lmin，6(TC退火30s，72°C延伸3min，共进行30个循环；最后72°C 延伸lOmin。PCR产物经过纯化后，获得完整基因。(3)用EcoRI和HindIII酶切步骤(2)制得的完整基因和载体pET_32a，然后将酶切后的完整基因连入PET3M，得Cellb表达质粒，利用pET-3h载体的测序通用引物，测序后，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。(4)将Cellb表达质粒利用热激法转化大肠杆菌Origami B (DE3)，在LB培养基中培养到OD600大约为0. 6时加入IPTG(终浓度为100 μ Μ)，20°C诱导过夜。IlOOOrpm,离心 2min，收集菌体后重悬于 Lysis Buffer (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, ImM PMSF, pH8. 0)；将上述菌体超声破碎，离心得到上清，对上清进行SDS-PAGE(以未诱导的菌体进行同样操作为对照)，发现上清中有明显的表达条带；该上清经过镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化，得到β -葡萄糖苷酶Cel lb，通过超滤离心更换缓冲液为pH7. O的50mM NaH2PO4缓冲液，分子量大约为68. 31kD，电泳验证如图2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。实施例2 β-葡萄糖苷酶Cellb的转糖基活性分析在300 μ 1反应体系中加入IOOyg实施例1制得的β -葡萄糖苷酶Cellb，20% 40% (w/v)的葡萄糖或10% 20% (w/v)的cellobiose，反应缓冲液为50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，不加酶的反应产物作为对照，45°C反应Mh。产物煮沸IOmin后离心取上清， 与bed resinTMD-8 (Sigma, USA)漩涡振荡混勻lmin，离心取上清，得到除去盐离子的上清， 使用带有RID-10A refractive index detector禾PBio-Rad Aminex HPX-42A carbohydrate column 的 LC-10AD HPLC (Shimadzu, Japan)分析产物。糖柱温度为 75°C，使用 ddH20 以 0. 4ml/min的流速洗脱。产物通过HPLC分析，如图2和图3，在以葡萄糖为底物时产生了纤维二糖)以纤维二糖为底物时产生了纤维三糖和纤维四糖。产量如图4，在上述反应体系中，以20% (w/v)葡萄糖和40% (w/v)葡萄糖为底物时，分别产生4. 6和56. 7mg/l的纤维二糖；以10% (w/v)纤维二糖为底物时，产生85. 8mg/l的纤维三糖和3. 2mg/l的纤维四糖； 以20% (w/v)纤维二糖为底物时，产生189. 6mg/l的纤维三糖和8. 6mg/l的纤维四糖。


本发明涉及β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种表达β-葡萄糖苷酶Cel1b的基因cel1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供一种β-葡萄糖苷酶Cel1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中的β-葡萄糖苷酶Cel1b可以用于工业上合成价格昂贵的纤维寡糖，进而应用于研究纤维素酶水解机理、微生物对纤维素的利用过程等。另外这种体外生物法合成的纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂，还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景广阔。