基于滤纸的生物大分子提取装置制造方法[0002]随着人类基因组测序项目的成功完成和下一代DNA测序技术的不断发展，基因分析检测正越来越得到人们的重视，并逐步推广应用于医疗保健、环境保护和司法鉴定等众多领域。为进一步推动基因分析的发展应用，实现整个检测流程的低成本、快速和自动化是十分必要的。而微流控技术在推动基因分析的发展上具有得天独厚的优势，并已取得长足的发展。[0003]通常核酸的分析过程包括如下三个步骤:核酸提取、靶序列的酶促扩增反应和产物的分离检测三个步骤。其中，作为第一步的核酸提取与纯化极为重要，它直接决定了后续过程的成功与否。[0004]传统的核酸提取方法有两种:一是酚氯仿抽提法，二是基于固相萃取的各种形式的核酸提取方法。[0005]酚氯仿抽提法具有成本低廉的优势，但由于涉及有毒有害试剂且操作繁琐，并不适合移植到微流控芯片上进行。[0006]基于固相萃取的各种形式的核酸提取方法主要是将核酸分子吸附在二氧化硅、玻璃、硅藻土等固体物质的表面来实现提取纯化的。目前很多市售的试剂盒都采取该方法，其形式也包括萃取膜、萃取柱、微球、粉末和磁`珠等。该方法相对而言适合于移植到微流体平台，各种基于此原理的微流控芯片已相继被研发出来。但毋庸置疑，这些样品制备芯片仍然有很多不足的地方，如成本高、加工步骤繁琐、操作繁琐等。[0007]低成本、快速和简便的核酸样品制备芯片仍然是人们的研究热点，它的研发对实现微型全分析系统，促进基因分析的进一步推广应用具有十分重要的意义。

[0008]本发明的目的是提供一种基于滤纸的生物大分子提取装置。
[0009]本发明提供的生物大分子提取装置(装置甲)，其特征在于:它由叠装的上层基片I和下层基片3以及夹持在所述上层基片和所述下层基片之间的滤纸2组成，所述上层基片、所述下层基片及滤纸之间形成至少一个生物大分子提取结构单元；
[0010]所述生物大分子提取结构单元的结构如下:所述上层基片上设有至少一个贯穿的进样孔4和一个贯穿的出样孔7;所述进样孔通过设于所述上层基片的下表面的上导流槽5与所述滤纸的上表面连通；所述出样孔通过设于所述下层基片的上表面的下导流槽6与所述滤纸的下表面连通；所述滤纸位于所述上导流槽和所述下导流槽的交汇区域，所述上导流槽和所述下导流槽之间仅通过所述滤纸相通。
[0011]所述上导流槽和所述下导流槽均为微流体管道。
[0012]所述上导流槽和所述下导流槽的宽度均为0.005-50毫米(如I毫米)，深度均为0.005-50晕米(如0.5晕米)。
[0013]所述上导流槽远离所述进样孔的一端的形状与所述滤纸的形状相应；所述下导流槽远离所述出样孔的一端的形状与所述滤纸的形状相应；所述下导流槽靠近所述出样孔的一端的形状与所述出样孔的形状相应。
[0014]所述上层基片上具体可设有3个所述进样孔。
[0015]本发明还保护另一种生物大分子提取装置(装置乙)，其特征在于:它由叠装的上层基片和下层基片以及夹持在所述上层基片和所述下层基片之间的滤纸组成，所述上层基片、所述下层基片及滤纸之间形成至少一个生物大分子提取结构单元；
[0016]所述生物大分子提取结构单元的结构如下:所述上层基片上设有一个贯穿的进样孔和一个贯穿的出样孔；所述进样孔与所述滤纸的上表面连通；所述出样孔通过设于所述下层基片的上表面的导流槽与所述滤纸的下表面连通；所述滤纸位于所述进样孔和所述导流槽的交汇区域，所述进样孔和所述导流槽之间仅通过所述滤纸相通。
[0017]所述导流槽为微流体管道。
[0018]所述导流槽的宽度为0.005-50毫米，深度为0.005-50毫米。
[0019]所述导流槽远离所述出样孔的一端的形状与所述滤纸的形状相应；所述导流槽靠近所述出样孔的一端的形状与所述出样孔的形状相应。
[0020]所述装置甲和/或所述装置乙中，所述滤纸的厚度可为0.01-5毫米(如0.15毫米)。
[0021]所述生物大分子具体可为核酸。所述核酸具体可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
[0022]具体可通过如下方法中的任意一种将所述滤纸夹持在所述上层基片和所述下层之间:热压、粘合剂粘合、物理键合或化学键合。
[0023]具体可通过如下方法中的任意一种将所述两个基片叠装在一起:热压、粘合剂粘合和双面胶带粘合。
[0024]所述上导流槽的横截面具体可为矩形，也可以是任何其它几何形状。所述下导流槽的横截面具体可为矩形，也可以是任何其它几何形状。所述导流槽的横截面具体可为矩形，也可以是任何其它几何形状。
[0025]所述滤纸的形状可为圆形、椭圆形、方形或菱形等。当所述滤纸为圆形时，其直径可为0.5-50毫米(如10毫米)。
[0026]所述滤纸为具有网状纤维结构的滤纸或者具有膜结构的滤纸。所述滤纸的孔径具体可为0.20-200微米，如20微米。
[0027]所述基片的材质可为如下材料中的至少一种:硅、陶瓷、玻璃、塑料、硅树脂和树脂。
[0028]常见的塑料材料包括:聚酰胺(PA)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(P0M)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯二乙醚(PPE)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSU)、聚醚醚酮(PEEK)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环烯烃共聚物(C0C)、娃树脂(Silicone)等。
[0029]所述上导流槽可以是由微加工或机加工等任何方式加工出来。根据所用基片材料的不同，其加工方法也不同，硅、玻璃和陶瓷可以通过各种湿法或干法刻蚀来加工，塑料、树脂等可以通过浇注、模压、刻蚀或机加工等方法加工。所述下导流槽可以是由微加工或机加工等任何方式加工出来。根据所用基片材料的不同，其加工方法也不同，硅、玻璃和陶瓷可以通过各种湿法或干法刻蚀来加工，塑料、树脂等可以通过浇注、模压、刻蚀或机加工等方法加工。所述导流槽可以是由微加工或机加工等任何方式加工出来。根据所用基片材料的不同，其加工方法也不同，硅、玻璃和陶瓷可以通过各种湿法或干法刻蚀来加工，塑料、树脂等可以通过浇注、模压、刻蚀或机加工等方法加工。
[0030]采用本发明提供的装置提取生物大分子，具有高效、快速、生物样本消耗量低、成本低廉、易于操作等优点。同时，本发明提供的装置也易于与下游生化分析芯片(如PCR芯片和毛细管电泳芯片等)进行集成连接。本发明对于实现微型全分析系统，促进基因分析的进一步推广应用具有十分重要的意义。
[0031]本发明提供的装置中，可以设置多个独立存在的生物大分子提取结构单元，使其形成阵列，从而实现对多个样品同时制备的高通量操作。



[0032]图1为生物大分子提取装置的结构示意图。
[0033]图2为生物大分子提取装置的分解图。
[0034]图3为生物大分子提取装置的工作原理示意图。
[0035]图4为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

[0036]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均`为常规`方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0037]实施例1、
[0038]本实施例中采用的生物大分子提取装置的结构示意图见图1，分解图见图2。生物大分子提取装置由叠装的上层基片I和下层基片3以及夹持在所述上层基片和所述下层基片之间的滤纸2组成，所述上层基片、所述下层基片及滤纸之间形成至少一个生物大分子提取结构单元。所述生物大分子提取结构单元的结构如下:上层基片上设有三个贯穿的进样孔(分别命名为进样孔甲、进样孔乙和进样孔丙)和一个贯穿的出样孔7。三个进样孔均通过设于上层基片的下表面的上导流槽5与滤纸的上表面连通。出样孔通过设于下层基片的上表面的下导流槽6与所述滤纸的下表面连通；所述滤纸位于所述上导流槽和所述下导流槽的交汇区域，所述上导流槽和所述下导流槽之间仅通过所述滤纸相通。出样孔从外部连接针泵。
[0039]本实施例中，所述滤纸通过热压夹持在所述上层基片和所述下层基片之间，所述两个基片通过热压叠装在一起，所述上导流槽和所述下导流槽均是采用刻蚀的方法加工得到的、横截面均呈矩形、宽度均为I毫米、深度均为0.5毫米，所述滤纸的形状为圆形(其直径为10毫米)、厚度为0.15毫米、孔径为20微米，所述上层基片和所述下层基片的材质均为塑料(聚甲基丙烯酸甲酯)。
[0040]应用本实施例提供的装置提取核酸时，在外部负压装置(针泵)的作用下，依次将用于提取核酸(DNA或RNA)的生物样本(液体形式)、裂解液和清洗液加入贯穿孔甲、贯穿孔乙和贯穿孔丙中，在外部负压的作用下，所有液体依次流过滤纸，利用滤纸的网状纤维结构对长链核酸分子的缠绕阻挡效应将其从生物样品中分离提取出来(工作原理示意图见图3)，可以将滤纸取出进行后续操作(如PCR扩增、分离检测等)，可也在装置中直接进行所述后续操作。
[0041]用于本实施例的生物样本为:人血液。
[0042]1、将生物样本通过进样孔甲加入生物大分子提取装置，在针泵的作用下通过上导流槽到达并吸附在滤纸上，其它液体从出样孔流出。
[0043]2、将细胞裂解液通过进样孔乙加入生物大分子提取装置，在针泵的作用下通过上导流槽到达滤纸，在细胞裂解液的作用下，生物样本中的细胞发生裂解，释放出核酸分子，核酸分子吸附在滤纸上，其它液体从出样孔流出。
[0044]细胞裂解液:IOmM NaOH水溶液。
[0045]3、将水通过进样孔丙加入生物大分子提取装置，在针泵的作用下依次通过上导流槽、滤纸,下导流槽并从出样孔流出，完成对核酸分子的清洗。
[0046]4、从生物大分子提取装置中取出滤纸，用打孔器打下2毫米的圆片，直接作为模板进行PCR扩增。
[0047]PCR扩增所用的引物如下:
[0048]上游引物:5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAA-3，；
[0049]下游引物:5’ -ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3 ’。
[0050]PCR扩增的靶序列为人基因组中的Ame1genin基因片段，如序列表的序列I所示。
[0051]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图4，其中，DL2000为分子量标准，NC为阴性对照(以水为模板)，PC为阳性对照(以序列I所示双链DNA为模板)，样品I至样品3为对三个生物样本进行试验。结果表明，采用本发明的装置提取得到的DNA完全可以作为PCR扩增的模板。