专利名称：编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA及其应用的制作方法草甘膦(Glyphosate)因理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解和不破坏土壤环境等优点，自1971年孟山都公司成功开发以来，备受市场青睐，现已成为全球销量最大的植物保护产品。由此，草甘膦也成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦作用靶标酶EPSP合成酶(EPSPS)基因的克隆、表达及其功能验证等也因此成为现代分子生物育种研究的重点。 在自然界中，植物和微生物都含有编码EPSP合成酶(EPSPS)的基因。植物中编码该合酶的基因为epsps,而在微生物中编码该合酶的基因为aroA。1983年孟山都公司和华盛顿大学的科学家分离得到了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) CP4,该株系的EPSPS对草甘膦不敏感，具有很高的抗性。1986年孟山都公司将CP4EPSPS基因导入到大豆基因组中，成功培育出抗草甘膦大豆新品种。此后科学家们分别从细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、可变盐单胞菌、假单胞菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结合分支杆菌中克隆得到编码EPSP合成酶的aroA基因，从拟南芥、烟草、牛筋草、小蓬草等植物中克隆得到了 epsps基因(He etal. , 2001 ；Borgesetal. , 2007 ；Melanie etal.,2005;Brotherton etal. , 2007;Dinelli etal.,2006;Zhaoetal. , 2011; Baerson etal.，2002;刘柱等，2004)。其中牛筋草、胡萝卜及烟草epsps基因可耐受 IOOuM 以下的草甘勝(Baerson etal. , 2002 ；Shyr etal. , 1992;Dyer etal. , 1988)，水稻epsps基因突变体可耐受IOOmM以下的草甘膦(Zhou etal.，2006);可变盐假单胞菌的EPSP合酶基因可耐受50mM以下的草甘膦(刘光全等，2004);人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)中的EPSP合酶基因可耐受300mM以下的草甘膦(金芜军等,2010)。目前关于杂草对草甘膦抗性机制有多方面的说法。Lorraine-Colwill等认为瑞士黑麦草抗性生物型和敏感生物型EPSPS酶的活性以及印sps基因序列都没有差异，主要是由植物体内的吸收输导差异而产生了对草甘膦的抗性。而Gaines等认为，EPSPS酶的表达量增加也可以使植物对草甘膦产生抗性。而草甘膦靶标酶EPSP合成酶基因epsps的核酸序列位点发生突变，致使生物体对草甘膦产生抗性，有很多研究报道。
为了克服现有转基因作物草甘膦抗性偏低的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因ar0AS(l(ll。本发明的另一目的在于提供上述基因UroAstltll)在提高农作物草甘膦抗性中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA■，其碱基序列如SEQID NO. 3 所示。上述基因(aroA.)是利用同源克隆的方法从一株高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)kpSOOl菌株中克隆得到的,该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6189。上述基因(aroAS(m)可用于提高农作物的草甘膦抗性，包括将aroA_、含有aroAS001的表达载体或克隆载体、含有上述表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果肺炎克雷伯氏菌ar0AS(l(ll基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA 基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。图I为实施例2中aroAS(m基因PCR扩增产物电泳图；其中M_DL2000Marker，l-aroAS001 基因 PCR 扩增产物(1284bp)。图2为实施例3中重组质粒pProA-aroAS(l(ll的菌落PCR检测结果图；其中，M-DL2000Marker, 1-9-第1_9号克隆的扩增结果。图3为实施例4中，kpSOOIEPSPS蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测结果图；M_低分子量标准蛋白，I-含空载体PProA菌株DH5 a IPTG诱导表达6小时，2-含pProA-aroAS(l(ll重组质粒菌株DH5 a IPTG诱导表达6小时。图4为实施例5中，分别转入pProA和pPr0A-ar0AS(l(ll质粒的ER2799菌株分别在含OmM和50mM草甘膦培养基中的生长曲线图；其中,aroAS001-0是转入ProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，aroAS(l(ll-50是转入Pr0A-ar0AS(l(ll质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-0是转入pProA质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-50是转入pProA质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图。图5为实施例5中，分别转入pProA和pProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图；其中，aroAS(l(ll是转入pProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图，pProA是转入pProA质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图。I、高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌的分离(I)取广东蔬菜田间土样10g，加入到90mL 150mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)中，置于37°C、120r/min培养72h。(2)取步骤(I)IOmL培养液加入到含200mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，370C、120r/min培养72h ;依此类推，将前一轮培养液逐级加入300、350、400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，370C、120r/min培养72h。(3)取适量培养液分别在含350mmol/L草甘膦的营养琼脂、马丁、高氏一号平板培养基上，划线分离。(4)挑取步骤(3)中的单菌落接种于含400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，37 0C、120r/min 培养 72h。(5)取适量培养液在含400mmol/L草甘膦的营养琼脂马丁高氏平板培养基上，划线分离。获得耐受400mmOl/L草甘膦的菌株。

2、利用革兰氏染色法，在显微镜下观察步骤I分离得到的菌株，为短杆状、单个、成双或短链状排列，革兰氏阴性杆菌。3、利用通用引物27F、1492R PCR扩增该菌株的16S DNA序列。PCR反应体系如下


本发明公开了一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001及其应用，该基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；该基因可用于提高农作物的草甘膦抗性，具体的是将基因aroAS001、含有基因aroAS001的表达载体或克隆载体，或含有上述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本发明的基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。