专利名称：黄柄鹅膏与共生植物室内共生关系的建立方法鹅膏菌属—)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属。鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，主要含鹅膏毒素，鹅膏毒素在研发抗菌抗病毒、抗肿瘤、镇静麻醉等新药方面具有潜在应用，因而成为了近年的研究热点。 鹅膏菌属绝大部分属于外生菌根真菌，目前尚不能进行人工栽培，难以开发利用，其子实体的生长发育与共生植物关系密切，因此鹅膏菌和其共生植物的生物学关系的研究，是进一步探讨鹅膏菌子实体发生机制的可行途径。黄柄鹅膏菌(Anianita flavipes Imai)是鹅膏属中的一个广布种，在云南武定狮子山分布较多，主要与壳斗科的滇青冈、元江栲iCastanopsis orthacantha)等阔叶树共生，滇青冈{Cyclobalanopsis glaucoides )为壳斗科(Fagaceae)、青冈属{Cyclobalanopsis Oerst.)植物,在狮子山阔叶林地上可以收集较多的滇青网种子，因此本发明以滇青R种子及黄柄鹅膏子实体为材料，成功地建立了黄柄鹅膏与滇青R的室内共生关系，为今后共生机理及鹅膏子实体发生的机制研究等提供了技术贮备。
本发明的目的在于，在室内或可控条件下建立一种简单稳定、互利互惠的黄柄鹅膏与滇青冈植物的共生关系。实现本发明的技术方案利用壳斗科滇青R植物种子，成功得到了无菌苗及盆栽苗，利用黄柄鹅膏子实体诱导了菌丝体，将菌丝体分别接种到无菌苗及盆栽苗根部，室内建立了二者的共生关系，实现本发明的主要步骤如下 (I)黄柄鹅膏菌丝体的诱导及培养野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约O. 08 O. 16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4N03 O. 30 O. 40g/L、谷氨酸 O. 28 O. 32 g/L、VB1 O. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L，控制 PH 值为5.4左右)表面，培养温度为22 23°C，暗培养14 18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53 60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基(马铃薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过80 100目分样筛)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(过80 100目分样筛)60. 00 80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I.50mg/L、麦芽汁200 230 ml/L、琼脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)进行扩大培养； (2)滇青R无菌苗的培养于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青R种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 S，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于O. 1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6 8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基(MS培养基，无糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA O. 08 O. 10mg/L，琼脂7.50g/L, pH为6. 80)，每瓶接种I颗，未污染的褐化种子于21 22°C下暗培养8 10天后生根开始萌发，转入2000 2500Lux的光照下相同温度再培养5 8天，长出I. 8 2. 3cm高的小苗时进行菌丝接种(接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22 23°C下培养13 16天，菌丝长满培养瓶，小苗高3. O 3. 5cm,叶3 5片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多)，建立起黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系；
(3)滇青R盆栽苗的培养将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒2 3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3 4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9 00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7 00左右将其移至室内保温；约25 30天种子发芽，待59 63天小苗长至4 5片真叶、高4 6cm时进行接种，接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种(每苗接种10 15块)，盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔13 15天，接种一次，共接种五次，118 122天，植株高10. O 13. Ocm,叶子9 11片，接种小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，建立起黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。本发明的有益效果是在室内以两种方式(无菌及盆栽)成功建立了黄柄鹅膏菌与滇青网的共生体系，其特点如下，
(O以滇青R种子，成功获得了无菌苗及盆栽菌，在可控条件下提供了两种滇青R植物的人工培养方法；
(2)建立的两种共生体系，各具特点，相互补充，无菌体系由于生长快，且为纯共生体，可以快速方便地研究二者的共生情况，盆栽苗由于自然生长，更接近野外原生境，可以将无菌条件下的一些实验结果直接用在盆栽苗上模拟或扩大实验；
(3)提供了菌根真菌与植物实验条件下共生关系的研究方法，为其它大型真菌与共生植物的研究提供了方法借鉴。

野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子 实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约O. 08 O. 16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 O. 30g/L、谷氨酸 O. 32 g/L、Vbi O. 10mg/L、麦芽汁150 ml/L、琼脂11. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为22 23°C，暗培养14天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基(马铃薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐叶干粉(过80目分样筛)30.00g/L、生境土干粉(过80目分样筛)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00g/L、NH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麦芽汁 200ml/L、琼脂 6. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)进行扩大培养；
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青R种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 S，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于0. 1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6 8次；将 处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基(MS培养基，无糖，6-BA I. 50mg/L, NAAO. 10mg/L，琼脂 7. 50 g/L, pH 为 6. 80)，每瓶接种 I 颗，未污染的褐化种子于21 22°C下暗培养8天后生根开始萌发，转入2000 2500Lux的光照下相同温度再培养5天，长出约2. Ocm高的小苗时进行菌丝接种(接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22 23°C下培养13天，菌丝长满培养瓶，小苗高约3. Ocm,叶4 5片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多)，建立起黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系；
将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒2天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3 4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9 00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右将其移至室内保温；约25天种子发芽，待60天小苗长至4 5片真叶、高约4cm时进行接种，接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种(每苗接种10块)，盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔13天，接种一次，共接种五次，118天，植株高约10. 0cm，叶子9 10片，接种小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，建立起黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。实例二
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 30g/L、谷氨酸 0. 32 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁150 ml/L、琼脂11. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为22 23°C，暗培养14天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基(马铃薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐叶干粉(过80目分样筛)30. 00g/L、生境土干粉(过80目分样筛)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00 g /UNH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麦芽汁200ml/L、琼脂6. OOg/L，控制PH值为5. 4左右)进行扩大培养；
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青R种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 S，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于0. 1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6 8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基(MS培养基，无糖，6-BA I. 50mg/L,NAA 0. 10mg/L，琼脂 7. 50 g/L，pH 为 6. 80)，每瓶接种 I 颗，未污染的褐化种子于21 22°C下暗培养10天后生根开始萌发，转入2000 2500Lux的光照下相同温度再培养8天，长出约I. 8cm高的小苗时进行菌丝接种(接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22 23°C下培养16天，菌丝长满培养瓶，小苗约高3. 5cm,叶3 4片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多)，建立起黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系；
将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3 4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9 00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右将其移至室内保温；约30天种子发芽，待63天小苗长至4 5片真叶、高约6cm时进行接种，接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种(每苗接种15块)，盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔15天，接种一次，共接种五次，122天，植株约高13. 0cm，叶子10 11片，接种小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，建立起黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。实例三
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁150 ml/L、琼脂11. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为22 23°C，暗培养16天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，55天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基(马铃薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过100目分样筛)50. 00g/L、生境土干粉(过100目分样筛)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麦芽汁 230 ml/L、琼脂 8. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)进行扩大培养；
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青R种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 S，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于O. 1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6 8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基(MS培养基，无糖，6-BA I. 00mg/L, NAA O. 08 mg/L，琼脂 7. 50 g/L，pH 为 6. 80)，每瓶接种 I 颗，未污染的褐化种子于21 22°C下暗培养9天后生根开始萌发，转入2000 2500Lux的光照下相同温度再培养7天，长出约2. 3cm高的小苗时进行菌丝接种(接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22 23°C下培养15天，菌丝长满培养瓶，小苗约高3. 3cm,叶3 4片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多)，建立起黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系；
将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3 4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9 :00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右将其移至室内保温；约27天种子发芽，待59天小苗长至4 5片真叶、高约5cm时进行接种，接种方法为将前面培 养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种(每苗接种13块)，盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔14天，接种一次，共接种五次，120天，植株约高12. 0cm，叶子9 10片，接种小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，建立起黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。实例四
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约O. 08 O. 16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁150 ml/L、琼脂11. 00g/L，控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为22 23°C，暗培养16天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，55天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基(马铃薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过100目分样筛)50. 00g/L、生境土干粉(过100目分样筛)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麦芽汁 230 ml/L、琼脂 8. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)进行扩大培养；
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青R种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 S，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于0. 1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6 8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基(MS培养基，无糖，6-BA I. 00mg/L, NAA 0. 08 mg/L，琼脂 7. 50 g/L，pH 为 6. 80)，每瓶接种 I 颗，未污染的褐化种子于21 22°C下暗培养8天后生根开始萌发，转入2000 2500Lux的光照下相同温度再培养6天，长出约2. Icm高的小苗时进行菌丝接种(接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将截取的6个菌丝块围绕培养瓶中的无菌小苗按6个方向等距接种，接种瓶苗于22 23°C下培养14天，菌丝长满培养瓶，小苗约高3. Icm,叶4 5片，总体上接种小苗比未接种小苗，茎杆粗状、叶色浓绿、叶片多)，建立起黄柄鹅膏菌丝与无菌小苗的共生关系；
将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度约3 4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9 00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右将其移至室内保温；约28天种子发芽，待61天小苗长至4 5片真叶、高约5cm时进行接种，接种方法为将前面培养皿中已扩繁的菌丝体用I cm直径的打孔器截取，将花盆中的土轻轻翻开露出根部，将截取的菌丝块围绕根部接种(每苗接种12块)，盖上泥土及腐叶，置于室外光照较好、空气清洁处培养，每隔15天，接种一次，共接种五次，121天，植株约高11. Ocm，叶子10 11片，接种 小苗比未接种小苗，植株及根系生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，建立起黄柄鹅膏菌丝与盆栽小苗的共生关系。


本发明涉及一种黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，属于生物技术领域(植物组织与真菌培养)。鹅膏菌绝大部分属于外生菌根真菌，目前尚不能进行人工栽培，难以开发利用，其子实体的生长发育与共生植物滇青冈等关系密切。本发明的特征为，利用黄柄鹅膏(A.flavipes)子实体诱导菌丝体，对菌丝体进行扩繁；利用野外采集的滇青冈(C.glaucoides)种子成功获得了无菌苗及盆栽苗，并将已扩繁的菌丝体分别接种到无菌苗及盆栽苗根部，接种苗比未接种苗生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，创新性地建立了黄柄鹅膏与滇青冈的室内共生关系，为今后共生机理及鹅膏子实体发生的机制研究等提供了技术贮备。