专利名称：凝乳酶分离提纯工艺的制作方法凝乳酶有三种状态液态、粉状和片剂，传统上利用牛犊第四胃的皱胃酶提取制作凝乳酶，近来凝乳酶的来源不断扩大，目前包括三类动物性凝乳酶，来源于牛胃和羊胃； 植物性凝乳酶，来源于无花果树液和菠萝果实；微生物凝乳酶，来源于霉菌和酵母菌。动物性凝乳酶是从犊牛或羔羊第四胃(皱胃)中提取的，为一种天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是限制性剪切由Wiel05-Metl06连接的K-酪蛋白，导致牛奶凝结。原奶中酪蛋白有三种α S-酪蛋白、β -酪蛋白和κ -酪蛋白，前两者易受Ca+2影响形成沉淀，而后者不仅稳定，而且还具有抑制前者沉淀的作用。凝乳酶使原奶凝固分为两个阶段首先将K -酪蛋白分解为副K -酪蛋白；其次副K -酪蛋白及α S-酪蛋白和β -酪蛋白在Cf2作用下沉淀。通常用量是IOOkg原奶添加20-40毫升凝乳酶溶液。凝乳时间与凝乳酶用量成反比，用量翻倍，则凝乳时间减半。不过用量影响干酪的成熟，用量大，则成熟期间蛋白质的分解会加快；同时由于凝乳酶分解蛋白质产生苦味肽，因此用量大也会增加干酪的苦味。由于凝乳酶具有性质稳定、牛乳凝结能力高，生产的奶酪没有苦味、风味良好、 组织状态适宜及产品得率高的特点，适宜于生产各种类型的奶酪。凝乳酶是奶酪生产中起重要作用的原料，随着奶酪工业的发展，奶酪产量逐年增加，对凝乳酶需求量不断增大，凝乳酶供应日益短缺。目前多从犊牛或羔羊皱胃中分离提取凝乳酶，但在对原料进行处理过程中易使酶活性降低或丧失，纯度较低。因此，提供一种凝乳酶的分离提纯工艺，具有重要意义。
有鉴于此，本发明提供一种凝乳酶分离提纯工艺。该分离提纯工艺采用二次真空冷冻干燥处理牛犊或羔羊皱胃内壁黏膜，在分离提纯过程中，能够较好地保持凝乳酶活性， 制得的凝乳酶纯度较好，收率较高。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了一种凝乳酶分离提纯工艺，包括如下步骤分离获得动物皱胃内壁黏膜；取所述黏膜在-35 45°C处理2 4h，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0.5 lh，获得第一原料；取所述第一原料经纯化后获得第二原料；取所述第二原料在-35 45°C处理2 4h，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0. 5 lh，即得。影响凝乳酶活性的因素主要有pH值在酸性环境中凝乳酶活力最强，原奶酸度的任何微小变化均能显著影响凝乳酶的活力。凝乳酶活力大部分来源于其中的胰蛋白酶，小部分来源于牛胃蛋白酶(不过猪凝乳酶中的有效成分是猪胃蛋白酶)。胰蛋白酶的最适PH为5. 4，而胃蛋白酶的最适PH 低于胰蛋白酶。温度凝乳酶的最适温度是42°C。(到55_60°C，酶本身受到破坏)因为乳温明显影响凝结速度。乳温30°C时原奶凝结时间是42°C的2-3倍。不过实际干酪生产中乳温通常保持在30-33°C，一是考虑到乳酸菌的最适温度(比如链球菌属的最适温度在30°C左右， 最高不能超过40°C ) ；二是较高乳温下凝块硬化速度太快，以至随后的切割比较困难。Cf2浓度只有原奶中存在自由钙离子时，被凝乳酶转化的酪蛋白才能凝结。因此钙离子浓度将会影响凝乳时间、凝块硬度和乳清排出。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种凝乳酶分离提纯工艺中，所述动物为犊牛或羔羊。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种凝乳酶分离提纯工艺中，所述纯化具体为，以g/mL计，所述第一原料与10 16% NaCl溶液的质量体积比为1 25 35，在 PH值为7. 0，15 25°C的条件下浸泡2 3d，调节pH值为2. 0，静置0. 5 Ih后，以4000r/ min条件下离心0. 5 lh，收集上清液过滤后，浓缩至相对密度为1. 49 (水分含量为45% )。本发明还提供了上述凝乳酶分离提纯工艺制得的凝乳酶。采用凝胶电泳方法进行蛋白质定性分析，使用蛋白质检测仪进行蛋白质定量测定。本发明提供一种凝乳酶分离提纯工艺。该分离提纯工艺采用二次真空冷冻干燥处理牛犊或羔羊皱胃内壁黏膜，在分离提纯过程中，能够较好地保持凝乳酶活性，制得的凝乳酶纯度可达95 98 %。试验表明，与现有凝乳酶成品比较，本发明提供的凝乳酶活性较高， 较市售成品酶活力增加8%。取黏膜在_15°C处理池，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0. 75h，获得第一原料8g ；取第一原料与16% NaCl溶液MOmL (质量体积比为1 30)，在pH值为7. 0，15°C 的条件下浸泡3d，调节pH值为2. 0，静置Ih后，以4000r/min条件下离心lh，收集上清液过滤后，浓缩至相对密度为1. 49 (水分含量为45% )后，获得第二原料14. 3g ；取第二原料在_15°C处理汕，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0. 75h， 得到淡黄色或白色固体粉末7. 84g。采用凝胶电泳方法进行蛋白质定性分析，使用蛋白质检测仪进行蛋白质定量测定。经检测，其为凝乳酶，酶活力为100万U/g，纯度为98%。实施例4取牛犊或羔羊皱胃，于内壁分离获得黏膜IOg ；取黏膜在25°C处理2.证，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0.证，获得第一原料8g ；取第一原料与16%妝(1溶液2241^(质量体积比为1 观)，在pH值为7. 0，22°C 的条件下浸泡2. 8d，调节pH值为2. 0，静置0. 后，以4000r/min条件下离心0. 7h，收集上清液过滤后，浓缩至相对密度为1. 49(水分含量为45% )后，获得第二原料14. Og ；取第二原料在25°C处理2.釙，在真空度为30pa的条件下真空冷冻干燥处理0. 5h， 得到淡黄色或白色固体粉末7. 6g。采用凝胶电泳方法进行蛋白质定性分析，使用蛋白质检测仪进行蛋白质定量测定。经检测，其为凝乳酶，酶活力为50万U/g，纯度为95%，菌落总数< lOOOcfu/g，大肠菌群< 30cfu/g，霉菌、酵母菌数< lOOcfu/g，沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌未检出。实施例5凝乳酶检测脱脂奶粉新西兰乳品公司。对照组凝乳酶成品，为市售产品。试验组凝乳酶产品，本发明实施例1至4提供的凝乳酶。凝乳酶活力测定凝乳酶活力测定及酶活力定义采用Arima法，1毫升凝乳酶溶液或1克干粉在 35°C条件下，40分钟内能凝结原奶的毫升数。实验测定方法取10ml 100g/L的脱脂乳代替原奶，在35°C下保温10分钟，加入 0.5ml 1 g/L本发明实施例1至4提供的凝乳酶溶液，迅速混合均勻，准确记录加入酶液凝固时间T(S)。酶活力(效价)单位定义把在40分钟内凝固1毫升100g/L脱脂乳所需酶量定义为一个索氏单位(Soxhlet Unit)。计算公式凝乳酶活力(效价)=(2400/T) X (5/0. 5) X D (稀释倍数)凝乳酶活力测定条件温度对凝乳酶活力的影响取脱脂乳粉9g溶于IOOmL水中，并用lmol/L HCL调整pH值至6. 4。取本发明实施例1至4提供的凝乳酶粉末Ig溶于IOOmL灭菌蒸馏水中，制成凝乳酶稀释液。分别于 30°〇、341、381、421、461、501、541下保温30111土11。吸取复原脱脂乳IOmL 于试管中。分别于 30°C、34°C、38°C、42°C、46°C、50°C、54°C 下保温30min。吸取ImL凝乳酶稀释液加入到上述装有脱脂乳溶液试管中，搅勻，30°C、34°C、 38 "C、42 °C、46 "C、50°C、54 "C 下保温。测定脱脂乳溶液出现凝集时间，并计算凝乳酶活力(效价)。结果见表1。表1不同温度条件下凝乳酶效价比较
本发明涉及动物活性成分提取技术领域，具体涉及凝乳酶分离提纯工艺。该分离提纯工艺采用二次真空冷冻干燥处理犊牛或羔羊皱胃内壁黏膜，在分离提纯过程中，能够较好地保持凝乳酶活性，制得的凝乳酶纯度较好，收率较高。